一种特异性结合GPC3的核酸适配体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种靶向GPC3的核酸适配体及其应用。本发明专利技术利用结合毛细管电泳的SELEX技术筛选与肝癌标志物GPC3特异性结合的核酸适配体，获得具有特异结合GPC3的适配体序列G625。所述的GPC3核酸适配体可用于设计、制备肝癌血清诊断试剂、肝癌组织切片染色试剂以及肝癌相关的活体成像造影剂。本发明专利技术将为肝癌的分子诊断提供新的思路，具有重要的临床价值。

Nucleic acid aptamers with specific binding to GPC3 and uses thereof

The present invention relates to a nucleic acid aptamer targeting GPC3 and uses thereof. The present invention utilizes a SELEX technique coupled with capillary electrophoresis to screen aptamer aptamers specifically associated with liver cancer marker GPC3 to obtain an aptamer sequence G625 having a specific binding GPC3. The GPC3 nucleic acid aptamers can be used for designing and preparing liver cancer serum diagnostic reagents, liver cancer tissue sections, staining reagents, and liver cancer related live imaging contrast agents. The invention provides a new idea for the molecular diagnosis of liver cancer, and has important clinical value.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种特异性结合GPC3的核酸适配体及其应用。
技术介绍
肝细胞肝癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，发病率在恶性肿瘤中位居世界第四位，死亡率位居第三位。中国占全球肝癌发病率及死亡率的一半，且发病率正在逐年升高。由于肝癌的特殊病理特点，患者早期常无症状，发现时多至中晚期，能接受包括外科手术、射频消融在内的“根治性”治疗的患者仅占20％左右，且长期疗效不理想，术后5年复发转移率高达60％-70％。因此，早期诊断与早期治疗是改善肝癌患者预后最有效的手段。目前，临床多采用检测甲胎蛋白(AFP)水平来进行肝癌血清学监测。但是早期肝癌，AFP阳性检出率低于50％，且相当数量的慢性肝炎及肝硬化病例其血清AFP水平呈阳性反应，存在一定的漏诊率和误诊率，不适合作为肝癌早期诊断的指标。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)是一个细胞膜蛋白，在原发性肝癌的发生发展中起重要作用，具有较高的敏感度和特异性，阳性检出率高于50％，在肝细胞癌中高表达，在肝脏良性病变及癌前病变中不表达或低表达，是原发性肝癌特别是AFP阴性肝癌的一个优选标记物。文献报道，GPC3联合AFP共同检测，阳性检出率可高达90％。在已有研究中，针对肝癌血清和组织的GPC3表达水平的检测都依赖于抗GPC3抗体，灵敏度和特异性已得到认可，但抗体本身存在许多不足之处，如成本高、易降解、批间差异大、不易储存和运输等；在肝癌影像诊断方面，仍局限在观察器官或组织的形态学改变上，并没有针对特定靶分子的影像诊断试剂。因此，筛选特异性结合GPC3的新型分子、建立诊断肝癌的新方法对于肝癌的早诊早治具有重要意义。核酸适配体(aptamer)，被称为“人工替代抗体”，是一种人工设计的单链寡核苷酸(ssDNA或RNA)，利用体外筛选技术即“指数富集的配体系统进化”技术(Systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，SELEX)获得，具有以三级结构(如发卡、口袋、凸环等)特异识别靶分子(如蛋白质、多肽、细胞、病毒、酶、染料分子等)的作用。核酸适配体的作用原理与抗体相似，同时又具有无免疫原性、可化学合成、易改造、成本低、稳定性好等优点，在临床诊断、新药开发以及基础研究中有着广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可特异性结合肝癌标志物GPC3的核酸适配体G625，所述GPC3特异性核酸适配体G625的序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术的另一个目的是提供GPC3特异性核酸适配体在肝癌诊断相关方面的应用。所述的GPC3特异性核酸适配体G625的应用包括：1)所述GPC3特异性核酸适配体G625在制备肝癌血清诊断试剂中的应用。2)所述GPC3特异性核酸适配体G625在肝癌组织切片染色中的应用。3)所述GPC3特异性核酸适配体G625在设计、制备肝癌相关的活体成像造影剂中的应用。本专利技术利用基于毛细管电泳分离的SELEX技术，以GPC3蛋白为靶标，通过6轮反复筛选，对富集文库进行克隆测序，分析测得序列的亲和力和特异性，最终获得与GPC3高特异性结合的核酸适配体。进一步地，本专利技术所述核酸适配体，在适配体的两端，可以进行基团修饰，所述修饰的基团包括但不局限于荧光分子、生物素、氨基、巯基、纳米物质、胆固醇或聚乙二醇基团。进一步地，可以对所述核酸适配体的碱基进行修饰，使其具有较未经修饰的核酸适配体更为优异的稳定性，所述修饰包括但不局限于硫代、锁核酸、氨代、氟代或甲氧基修饰。进一步地，将所述核酸适配体用于肝癌的体外、体内诊断，其中包括但不局限于酶联免疫反应、放射免疫测定、荧光方法检测及产品。本专利技术优点在于：1.本专利技术提供的GPC3特异性核酸适配体G625识别、结合GPC3的能力强，且合成简单、易修饰、稳定性好、成本低。相较之下，常规抗体工艺复杂、成本高、易降解、不易改造。2.利用本专利技术的核酸适配体能够建立诊断肝癌的新方法，通过相应检测标定物的偶联，可进行肝癌的定性或定量检测。附图说明图1是本专利技术实施例中G625与GPC3蛋白结合力测定信号图；图2是本专利技术实施例中流式细胞仪测定G625对Huh7和A549细胞的偏移；图3是本专利技术实施例中流式细胞仪测定G625对Huh7和A549细胞的解离常数。具体实施方式下面结合附图对本专利技术提供的具体实施方式作详细说明，实施例中未详细说明的操作步骤请参阅《分子克隆》及所用仪器、试剂的说明书。实施例1核酸适配体的筛选1.设计并合成全长75个碱基的随机寡核苷酸文库，序列如SEQIDNO.2所示，其中两端分别为20个碱基的固定序列，中间35个碱基为随机序列。2.合成用于PCR扩增的上游引物(SEQIDNO.3)和下游引物(SEQIDNO.4)。3.P/ACEMDQ毛细管电泳仪(美国Beckman-Coulter公司)，配备二极管阵列(PDA)。电泳缓冲液为30mMNaH2PO3、pH7.5；分离电压-8kV，加压34mbar；温度25℃；压力34mbar进样随机寡核苷酸文库(10μM)与GPC3(0.1mg/ml)混合物(体积比1：1)10s；检测波长256nm。收集游离寡核苷酸峰后至蛋白峰间的结合寡核苷酸。4.取步骤3中收集到的与GPC3结合的寡核苷酸进行扩增，扩增条件为：94℃，3min；94℃，30s，58℃，30s，72℃，30s，扩增10个循环；72℃，5min。5.取链霉亲和素偶联的磁珠，结合步骤4中获得的PCR扩增产物，常温孵育20min，将双链DNA吸附到磁珠表面。加入150mMNaOH溶液常温变性5min，再用150mMHAc溶液中和，中和产物PAGE切胶纯化，纯化产物用于下一轮筛选。6.根据步骤3、4、5循环6次，富集能与GPC3特异性结合的寡核苷酸。实施例2核酸适配体的克隆与测序在微量离心管中配制下列溶液，全量为5μl：pMD19-TVector1μl，适配体PCR产物0.2pmol，ddH2O补充至5μl。加入5μl的SolutionI。16℃反应30min。全量(10μl)加入至100μlTrans5α感受态细胞中，冰中放置30min。42℃加热45s后，再在冰中放置1min。加入890μlLB培养基，37℃振荡培养60min。在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB琼脂平板培养基上37℃培养，形成单菌落。挑选白色单克隆菌落至2mlLB(Amp80μg/ml)液体培养基中，200rpm、37℃振荡培养16h，菌液交由上海生工测序。实施例3核酸适配体的验证测序得到82条序列。对测序结果进行整理分析，得到20条碱基组成不同的适配体序列。经结合力分析，获得特异性结合GPC3的核酸适配体G625。G625的序列如SEQIDNO.1所示。考察1：生物膜干涉技术检测G625与GPC3蛋白的结合能力采用ForteBioOctetRed96生物分子相互作用仪对G625与GPC3蛋白的结合能力进行检测。用PBSpH7.4稀释生物素标记的G625(Bio-G625)，至浓度为1μM。将Bio-G625偶联到SA传感器上，平衡。之后将结合了G625的传感器置于一系列不同浓度(0、75、150、375、7本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异性结合GPC3的核酸适配体，其特征在于其序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种特异性结合GPC3的核酸适配体，其特征在于其序列如SEQIDNO.1所示。2.如权利要求1所述的特异性结合GPC3的核酸适配体，其特征在于所述核酸适配体的两端中至少一端具有修饰基团。3.如权利要求1所述的特异性结合GPC3的核酸适配体，其特征在于所述核酸适配体具有碱基修饰。4.如权利要求1-3任一项所述的特异性结合GPC3的核...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴伟忠，冬黎黎，胡洪卫，郭玮，高兴辉，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，上海艾津生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31