用于检测蜂蜜的组合物、试剂盒、检测方法及应用技术

本发明专利技术涉及用于蜂蜜中龙眼、荔枝、洋槐、油菜蜜源植物成分检测的寡核苷酸引物及探针，包含所述引物及探针的试剂盒，以及利用其检测蜂蜜中上述蜜源植物成分的方法。通过本发明专利技术，能够简单、快速、特异且灵敏地检测蜂蜜中的上述蜜源植物成分。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体而言，本专利技术涉及用于检测蜂蜜中蜜源植物成分的寡核苷酸引物和探针，包含所述引物和探针的试剂盒，以及使用所述引物和探针或试剂盒检测蜂蜜中蜜源植物成分的方法。本专利技术还涉及所述弓I物和探针在检测蜂蜜中蜜源植物成分中的应用。
技术介绍
蜂蜜，是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物结合后，经充分酿造而成的天然甜味物质。蜜源植物种类繁多，如油菜蜜、槐花蜜、荆条蜜、枣花蜜、龙眼蜜、荔枝蜜等等。不同蜜源蜂蜜价格相差较大，高端价位如龙眼蜜和荔枝蜜，低端价位如油菜蜜等。蜂蜜掺假中一种较为普遍的做法是将低价蜜源蜂蜜掺入高价蜜源蜂蜜。针对这类掺假，传统的检测方法，如感官法、物理性状、化学成分分析等，由于受到生产、加工、贮藏条件影响存在很多不确定性。分子生物学技术通过检测植物物种特异性基因片段来判断蜜源，具有特异性强，灵敏度高，不易受环境条件干扰，结果稳定等优点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，简单、快速、特异且灵敏地检测蜂蜜中的荔枝、龙眼、洋槐、油菜蜜源植物成分。通过本专利技术，不仅能检测蜂蜜中花粉沉淀中提取的DNA，而且能检测蜂蜜上清中提取的DNA，能有效防止蜂蜜中添加花粉或过滤花粉的造假方式。本专利技术的专利技术人根据油菜的隐花色素2b基因，设计了能够特异性检测油菜成分的引物和探针；根据洋 槐叶绿体pseudoacacia maturase K基因,设计了特异性检测洋槐成分的引物和探针；根据荔枝成熟酶K基因，设计了能同时特异性检测荔枝和龙眼成分的引物和探针。根据龙眼叶绿体铁超氧化物歧化酶(FSDlb)基因，设计了特异性检测龙眼成分的引物和探针。这些基因靶序列小于lOObp，保证能从蜂蜜沉淀及上清中检测目标植物成分。所述油菜特异性上游引物为fcas-cry-F:GAGGATAACCCCGCACTAGC(SEQ ID N0.1),下游引物为 Bras-cry-R:GGTGGGAGCCAAGAGACTTC(SEQ ID N0.2);探针为 fcas-cry-P: TTTTCATTTGGTGCCCTGAAGAAGAAGG(SEQ ID N0.3)，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。洋槐特异性上游引物为Rob-matK-F:GCTCAACCAGGAACGATC (SEQ ID N0.4),下游引物为 Rob-matK-R:GCAGCATTTGACTACGTACCA (SEQ ID N0.5)；探针为 Rob-matK-P:CATAAACCTATTATCCGAACATTCATTTCA(SEQ ID N0.6)，在探针的 3’ 端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。龙眼和荔枝特异性上游引物为 Lit-matK-F: TCATGTGTGGTCTCAACCCG (SEQ ID N0.7),下游引物为 LitiatK-R:CGTCGCCGACTGGAAAGATA (SEQ ID N0.8);探针为 Lit-matK_P:TTACACAAAGATTCTATCAACTTTCTGGGC(SEQ ID N0.9)，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。龙眼特异性上游引物为Longan-FSD-F:CCCAAGCTTCCTGATTGGGT(SEQ IDN0.10),下游引物为 Longan-FSD-R:AGGTGGTGTTTGTCGCTTCT (SEQ ID N0.11);探针为 Longan-FSD-P:CTTCATTGAAAGAAAGGCATAACTAG(SEQ ID N0.12)，在探针的 3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。一方面，本专利技术提供了用于通过实时荧光PCR方法鉴别蜂蜜中蜜源植物成分的组合物，所述组合物包含选自以下(I)至(4)中的任意一组或多组引物和探针序列:(I)油菜特异性寡核苷酸引物对SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2以及探针SEQ IDN0.3序列；(2)洋槐特异性寡核苷酸引物对SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5以及探针SEQ IDN0.6序列；(3)荔枝和龙眼特异性寡核苷酸引物对SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8以及探针SEQID N0.9 序列；(4)龙眼特异性寡核苷酸引物对SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.11以及探针SEQ IDN0.12序列。在一个实施方式中，在探针的3’端连接有荧光淬灭基团，5’端连接有荧光报告基团。在一个实施方式中，所述荧光淬灭基团为TARMA，所述荧光报告基团为FAM。在本专利技术中，蜜源植物为荔枝、龙眼、洋槐和油菜中的一种或多种。另一方面，本专利技术提供了用于通过实时荧光PCR方法鉴别蜂蜜中蜜源植物成分的试剂盒，所述试剂盒包括本专利技术的所述组合物。 在一个实施方案，本专利技术提供了用于快速检测蜂蜜中荔枝、洋槐、油菜、龙眼蜜源植物成分的试剂盒，所述试剂盒包括本专利技术的用于实时荧光PCR方法检测蜂蜜中荔枝、洋槐、油菜、龙眼蜜源植物成分的特异性寡核苷酸引物对以及探针和使用说明书。在优选的实施方案中，所述试剂盒还包括用于样品DNA提取的试剂和用于PCR反应的试剂。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的使用说明书中包括对用于快速检测蜂蜜中荔枝、洋槐、油菜、龙眼蜜源植物成分的PCR扩增的条件的描述。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的说明书中给出的PCR扩增条件是:95°C，IOmin ；95°C 15s，60°C lmin，40个循环。在一个具体的实施方案中，本专利技术的用于检测蜂蜜中荔枝、洋槐、油菜、龙眼蜜源植物成分的试剂盒还包括标准品和对照品。优选地，对照品包括阳性对照品和阴性对照品。在一个实施方案中，阴性对照为无菌双蒸水。再一方面，本专利技术提供了蜂蜜中蜜源植物成分鉴别的实时荧光PCR检测方法，所述方法包括使用本专利技术的所述组合物或试剂盒。在一个实施方式中，PCR扩增条件是95°C，IOmin ；95°C 15s，60°C lmin，40个循环。优选地，本专利技术所使用的实时荧光PCR方法为Taqman荧光探针法。在一个实施方案中，本专利技术的蜂蜜中荔枝、龙眼、洋槐、油菜蜜源植物成分实时荧光PCR检测方法还进一步包括提取样品总DNA和确定特异性寡核苷酸引物和探针组合的相对检测限的步骤。在本专利技术中，所述实时荧光PCR检测方法检测出荔枝或龙眼成分的检测限为0.0005ng/l.! L，洋槐成分的检测限为0.0005ng/μ L，油菜成分的检测限为0.005ng/l.! L，龙眼成分的检测限为0.005ng/y L。在本专利技术中，所述实施荧光PCR检测方法检测荔枝蜜与油菜蜜混样沉淀DNA，其中荔枝成分检测限为0.1%，油菜成分的检测限为0.1% ;上清DNA中荔枝成分检测限为0.1%，油菜成分检测限为5%。在本专利技术中，所述实施荧光PCR检测方法检测龙眼蜜与洋槐蜜混样沉淀DNA，其中龙眼成分检测限为1%，洋槐成分的检测限为0.1% ;上清DNA中龙眼成分检测限为1%，洋槐成分检测限为0.1%。再在一方面，本专利技术提供了本专利技术的所述组合物或所述试剂盒在鉴别蜂蜜中蜜源植物成分中的应用。实时荧光定量本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于通过实时荧光PCR方法鉴别蜂蜜中蜜源植物成分的组合物，所述组合物包含选自以下（1）至（4）中的任意一组或多组引物和探针序列：（1）油菜特异性寡核苷酸引物对SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2以及探针SEQ?ID?No.3序列；（2）洋槐特异性寡核苷酸引物对SEQ?ID?No.4和SEQ?ID?No.5以及探针SEQ?ID?No.6序列；（3）荔枝和龙眼特异性寡核苷酸引物对SEQ?ID?No.7和SEQ?ID?No.8以及探针SEQ?ID?No.9序列；（4）龙眼特异性寡核苷酸引物对SEQ?ID?No.10和SEQ?ID?No.11以及探针SEQ?ID?No.12序列。

【技术特征摘要】
1.用于通过实时荧光PCR方法鉴别蜂蜜中蜜源植物成分的组合物，所述组合物包含选自以下(I)至(4)中的任意一组或多组引物和探针序列: Cl)油菜特异性寡核苷酸引物对SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2以及探针SEQ ID N0.3序列； (2)洋槐特异性寡核苷酸引物对SEQID N0.4和SEQ ID N0.5以及探针SEQ ID N0.6序列； (3)荔枝和龙眼特异性寡核苷酸引物对SEQID N0.7和SEQ ID N0.8以及探针SEQ IDN0.9序列； (4)龙眼特异性 寡核苷酸引物对SEQID N0.10和SEQ ID N0.11以及探针SEQ ID N0.12序列。2.根据权利要求1所述的组合物，其中，在探针的...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴亚君，陈颖，王斌，刘明畅，韩建勋，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：