【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】PCSK9的基因编辑相关申请本申请要求2016年12月23日提交的美国临时申请U.S.S.N.62/438,869的根据35U.S.C.§119(e)的优先权，其通过引用并入本文。政府支持本专利技术是在国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)授予的拨款号GM065865下得到政府支持完成的。政府拥有本专利技术的某些权利。专利技术背景肝脏蛋白质前蛋白质转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin9型(PCSK9)是一种分泌性、球状、自体激活丝氨酸蛋白酶，其起内体囊泡内的蛋白质结合衔接物作用以在低密度脂蛋白(LDL)颗粒的胞吞作用期间桥接与LDL受体(LDL-R)的pH依赖性相互作用，从而阻止LDL-R再循环到细胞表面并导致LDL-胆固醇清除降低。阻断或抑制PCSK9的功能以加强LDL-R介导的LDL胆固醇清除在制药业中具有重要意义。然而，目前在体内生成PCSK9保护性变体和功能丧失突变体的方法由于需要修饰大量细胞以调控胆固醇水平而是无效的。其他担忧涉及可能由基因组编辑引起的脱靶效应、基因组不稳定性或致癌性修饰。专利技术概述本文提供的是用于修饰编码PCSK9蛋白的多核苷酸(例如DNA)以产生功能丧失PCSK9变体的系统、组合物、试剂盒和方法。本文还提供的是用于修饰编码LDLR、IDOL或APOC3/C5蛋白的多核苷酸(例如DNA)以产生功能丧失变体的系统、组合物、试剂盒和方法。用于产生突变体的方法学依赖于基于CRISPR/Cas9的碱基编辑技术。本文所述的精确靶向方法优于先前提出的策略，其使用工程化的核酸酶在PCSK9基因组基因座或本文所述的其...
【技术保护点】
1.编辑编码前蛋白质转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin 9型(PCSK9)蛋白的多核苷酸的方法，所述方法包括使编码PCSK9的多核苷酸接触：(i)融合蛋白，其包含：(a)引导核苷酸序列‑可编程DNA结合蛋白域；和(b)胞嘧啶脱氨酶域；和(ii)引导核苷酸序列，其将(i)的所述融合蛋白靶向到所述编码PCSK9的多核苷酸中的靶胞嘧啶(C)碱基，其中所述接触导致所述融合蛋白对所述靶C碱基的脱氨基，从而导致所述编码PCSK9的多核苷酸中胞嘧啶(C)至胸腺嘧啶(T)变化。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.12.23 US 62/438,8691.编辑编码前蛋白质转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin9型(PCSK9)蛋白的多核苷酸的方法，所述方法包括使编码PCSK9的多核苷酸接触：(i)融合蛋白，其包含：(a)引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域；和(b)胞嘧啶脱氨酶域；和(ii)引导核苷酸序列，其将(i)的所述融合蛋白靶向到所述编码PCSK9的多核苷酸中的靶胞嘧啶(C)碱基，其中所述接触导致所述融合蛋白对所述靶C碱基的脱氨基，从而导致所述编码PCSK9的多核苷酸中胞嘧啶(C)至胸腺嘧啶(T)变化。2.权利要求1的方法，其中所述引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白是切口酶。3.权利要求2的方法，其中所述切口酶是Cas9切口酶。4.权利要求3的方法，其中所述Cas9切口酶包含对应于SEQIDNO:1中D10A突变或H840A突变的突变。5.权利要求4的方法，其中所述Cas9切口酶包含对应于SEQIDNO:1中D10A突变的突变。6.权利要求1的方法，其中所述引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域选自下组：核酸酶无活性的Cas9(dCas9)域、核酸酶无活性的Cpf1域、核酸酶无活性的Argonaute域，及其变体。7.权利要求6的方法，其中所述引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域是核酸酶无活性的Cas9(dCas9)域。8.权利要求7的方法，其中所述dCas9域的氨基酸序列包含对应于SEQIDNO:1中D10A和/或H840A突变的突变。9.权利要求7的方法，其中所述dCas9域的氨基酸序列包含对应于SEQIDNO:1中D10A突变的突变，并且其中所述dCas9域包含对应于SEQIDNO:1的氨基酸840的位置处的组氨酸。10.权利要求1的方法，其中所述引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域包含核酸酶无活性的Cpf1(dCpf1)域。11.权利要求10的方法，其中所述dCpf1域来自氨基酸球菌属(Acidaminococcus)或毛螺菌科(Lachnospiraceae)的物种。12.权利要求1的方法，其中所述引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域包含核酸酶无活性的Argonaute(dAgo)域。13.权利要求12的方法，其中所述dAgo域来自格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacteriumgregoryi)(dNgAgo)。14.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述胞嘧啶脱氨酶域包含载脂蛋白BmRNA-编辑复合物(APOBEC)家族脱氨酶。15.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述胞嘧啶脱氨酶选自下组：APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D、APOBEC3F、APOBEC3G脱氨酶、APOBEC3H脱氨酶、APOBEC4脱氨酶、激活诱导的脱氨酶(AID)和pmCDA1。16.权利要求1的方法，其中所述胞嘧啶脱氨酶包含SEQIDNO:271-292和303的任一个的氨基酸序列。17.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述(i)的融合蛋白进一步包含Gam蛋白。18.权利要求17的方法，其中所述Gam蛋白包含SEQIDNO:2030-2058的任一个的氨基酸序列。19.权利要求1-18中任一项的方法，其中所述(a)的融合蛋白进一步包含尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)域。20.权利要求19的方法，其中所述UGI域包含SEQIDNO:304的氨基酸序列。21.权利要求19或20的方法，其中所述胞嘧啶脱氨酶域与所述引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的N端融合。22.权利要求21的方法，其中所述UGI域与所述引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的C端融合。23.权利要求1-22中任一项的方法，其中所述胞嘧啶脱氨酶和所述引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域经由任选的接头融合。24.权利要求23的方法，其中所述UGI域经由任选的接头与所述dCas9域融合。25.权利要求24的方法，其中所述融合蛋白包含结构NH2-[胞嘧啶脱氨酶域]-[任选的接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域]-[任选的接头序列]-[UGI域]-COOH。26.权利要求23-25中任一项的方法，其中所述接头包含(GGGS)n(SEQIDNO:1998)、(GGGGS)n(SEQIDNO:308)、(G)n、(EAAAK)n(SEQIDNO:309)、(GGS)n、SGSETPGTSESATPES(SEQIDNO:310)或(XP)n基序，或任何这些的组合，其中n独立地是1和30之间的整数，并且其中X是任何氨基酸。27.权利要求26的方法，其中所述接头包含氨基酸序列SGSETPGTSESATPES(SEQIDNO:310)。28.权利要求26的方法，其中所述接头是(GGS)n，并且其中n是1、3或7。29.权利要求1的方法，其中所述融合蛋白包含SEQIDNO:10或293-302的任一个的氨基酸序列。30.权利要求1-29中任一项的方法，其中所述编码PCSK9蛋白的多核苷酸包含编码链和互补链。31.权利要求1-30中任一项的方法，其中所述编码PCSK9蛋白的多核苷酸包含编码区和非编码区。32.权利要求1-31中任一项的方法，其中所述C至T变化发生在所述编码PCSK9的多核苷酸的编码序列中。33.权利要求32的方法，其中所述C至T变化导致所述PCSK9蛋白中的突变。34.权利要求33的方法，其中所述PCSK9蛋白中的所述突变是功能丧失突变。35.权利要求34的方法，其中所述突变选自表3中列出的突变。36.权利要求35的方法，其中所述引导核苷酸序列选自表3中列出的引导核苷酸序列。37.权利要求34的方法，其中所述功能丧失突变在所述PCSK9编码序列中引入提前终止密码子，其导致截短的或非功能性的PCSK9蛋白。38.权利要求37的方法，其中所述提前终止密码子是TAG(琥珀)、TGA(乳白)或TAA(赭石)。39.权利要求38的方法，其中所述提前终止密码子经由所述编码链上的第一个C的脱氨基从CAG至TAG变化生成。40.权利要求38的方法，其中所述提前终止密码子经由所述编码链上的第一个C的脱氨基从CGA至TGA变化生成。41.权利要求38的方法，其中所述提前终止密码子经由所述编码链上的第一个C的脱氨基从CAA至TAA变化生成。42.权利要求38的方法，其中所述提前终止密码子经由所述互补链上的第二个C的脱氨基从TGG至TAG变化生成。43.权利要求38的方法，其中所述提前终止密码子经由所述互补链上的第三个C的脱氨基从TGG至TGA变化生成。44.权利要求38的方法，其中所述提前终止密码子经由所述编码链上的C的脱氨基和所述互补链上的C的脱氨基从CGG至TAG或CGA至TAA变化生成。45.权利要求37-44中任一项的方法，其中所述引导核苷酸序列选自表6中列出的引导核苷酸序列(SEQIDNO:938-1123)。46.权利要求37的方法，其中引入串联的提前终止密码子。47.权利要求46的方法，其中所述突变选自下组：W10X-W11X、Q99X-Q101X、Q342X-Q344X和Q554X-Q555X，其中X是终止密码子。48.权利要求37的方法，其中所述提前终止密码子在结构上去稳定化突变后引入。49.权利要求48的方法，其中所述去稳定化突变选自下组：P530S/L、P581S/L和P618S/L。50.权利要求48的方法，其中所述提前终止密码子选自下组：Q531X、R582X和Q619X，其中X是终止密码子。51.权利要求50的方法，其中用于引入所述提前终止密码子的所述引导核苷酸序列选自SEQIDNO:938-1123，并且其中用于引入所述结构上去稳定化突变的所述引导核苷酸序列选自SEQIDNO:579-937。52.权利要求34的方法，其中所述突变使PCSK9蛋白质折叠去稳定化。53.权利要求52的方法，其中所述突变选自表4中列出的突变。54.权利要求53的方法，其中所述引导核苷酸序列选自表4中列出的引导核苷酸序列(SEQIDNO:579-937)。55.权利要求1-31中任一项的方法，其中所述C至T变化发生在所述编码PCSK9的多核苷酸的非编码区中的剪接位点处。56.权利要求55的方法，其中所述C至T变化发生在内含子-外显子接合处。57.权利要求55的方法，其中所述C至T变化发生在剪接供体位点处。58.权利要求55的方法，其中所述C至T变化发生在剪接受体位点处。59.权利要求55的方法，其中所述C至T变化发生在与起始密码子(AUG)中G碱基配对的C碱基处。60.权利要求55-59中任一项的方法，其中所述C至T变化阻止PCSK9mRNA成熟或消除PCSK9表达。61.权利要求60的方法，其中所述引导核苷酸序列选自表8中列出的引导核苷酸序列(SEQIDNO:1124-1309)。62.权利要求1-61中任一项的方法，其中PAM序列位于变化的C的3’。63.权利要求1-61中任一项的方法，其中PAM序列位于变化的C的5’。64.权利要求62的方法，其中所述PAM序列选自下组：NGG、NGAN、NGNG、NGAG、NGCG、NNGRRT、NGGNG、NGRRN、NNNRRT、NNNGATT、NNAGAA和NAAAC，其中Y是嘧啶，R是嘌呤以及N是任何核碱基。65.权利要求63的方法，其中所述PAM序列选自下组：NNT、NNNT和YNT，其中Y是嘧啶以及N是任何核碱基。66.权利要求1-61中任一项的方法，其中没有PAM序列位于所述靶C碱基的3’。67.权利要求1-61中任一项的方法，其中没有PAM序列位于所述靶C碱基的5’。68.权利要求1-61中任一项的方法，其中没有PAM序列位于所述靶C碱基的3’或5’。69.权利要求1-68中任一项的方法，其中将至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变引入到所述编码PCSK9的多核苷酸中。70.权...
【专利技术属性】
技术研发人员：JP麦安蒂，DR刘，
申请(专利权)人：哈佛大学的校长及成员们，
类型：发明
国别省市：美国,US
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