使用包含硫代磷酸酯基的寡核苷酸的聚合酶链式反应检测系统技术方案
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种在试验系统中用于检测核酸的方法和试剂盒。
技术介绍
聚合酶链式反应(PCR)是一种快速且指数式扩增目标核酸序列的有力方法。PCR促进了基因表征和分子克隆技术的发展，包括PCR扩增的DNA的直接测序、等位基因变异的测定以及传染性和遗传性疾病病症的检测。通过下述重复循环进行PCR：将含有目标序列的DNA模板热变性、将反向引物与互补DNA链退火和使用DNA聚合酶将退火的引物延伸。多重PCR循环导致由侧翼扩增引物圈定的核苷酸序列指数式扩增。在PCR方案中加入热稳定的DNA聚合酶避免了重复添加酶的需要并使退火和引物延伸的温度提高，该温度提高了引物：模板相关的特异性。因此，Taq DNA聚合酶可用于增加PCR的特异性和简便性。在许多基于PCR的反应中，采用信号生成系统，如用于检测扩增产物的产生。在基于PCR的反应中所使用的信号生成系统之一是荧光能量转移(FRET)系统，其中核酸检测物(detector)包括荧光供体和受体基团。FRET标记系统具有许多优于其它标记系统的优势，包括进行匀相试验的能力，其中并不需要结合的与未结合的标记的核酸检测器的分离步骤。许多现有技术的主要问题与双标记的荧光寡核苷酸的合成相关。欧洲专利申请EP1726664公开了一种解决这一问题的检测系统，其使用具有不同解链温度(Tm)的单标记的寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列在理想溶液(free solution)中彼此杂交以形...
【技术保护点】
一种减少模板依赖的引物延伸反应中的非特异性扩增和/或引物二聚体形成的方法，其包括在缺少3'→5'核酸酶活性的聚合酶存在下进行引物延伸反应，其中一个或多个引物包含至少一个硫代磷酸酯基团。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种减少模板依赖的引物延伸反应中的非特异性扩增和/或引物二聚体
形成的方法，其包括在缺少3'→5'核酸酶活性的聚合酶存在下进行引物延伸
反应，其中一个或多个引物包含至少一个硫代磷酸酯基团。
2.一种检测在缺少3'→5'外切酶活性的聚合酶存在下产生的引物延伸产
物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供至少两个在理想溶液中相互杂交以形成荧光猝灭对并通过引入互
补于一个或两个序列的互补序列而产生可测量信号的单标记的寡核苷酸序
列，其中寡核苷酸序列中的至少一个包含至少一个硫代磷酸酯基团；
b)提供至少一个引物并起始引物延伸反应，从而产生互补于单标记的寡
核苷酸序列中的至少一个的序列；和
c)测量所产生的可检测信号。
3.一种检测在缺少3'→5'外切酶活性的聚合酶存在下产生的引物延伸产
物的试剂盒，其包含至少两个在理想溶液中相互杂交以形成荧光猝灭对并通
过引入互补于一个或两个序列的互补序列而产生可测量信号的单标记的寡核
苷酸序列，其中寡核苷酸序列中的至少一个包含至少一个硫代磷酸酯基团。
4.如权利要求2或3所述的方法或试剂盒，其中第一和第二寡核苷酸序
列具有不同的Tm。
5.如权利要求4所述的方法或试剂盒，其中第一和第二寡核苷酸序列之
一具有等于或低于引物延伸反应的Ta的Tm。
6.如权利要求4或5所述的方法或试剂盒，其中第一和第二寡核苷酸序
列之一具有高于引物延伸反应的Ta的Tm。
7.一种检测在缺少3'→5'外切酶活性的聚合酶存在下通过使用PCR产生
的引物延伸产物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供第一单标记的寡核苷酸序列和至少一种第二单标记的寡核苷酸序
列和至少一种引物，第一和第二寡核苷酸序列具有不同的Tm，其中第一和
第二寡核苷酸序列在理想溶液中相互杂交以形成荧光猝灭对，第一和第二寡
核苷酸序列之一具有等于或低于PCR过程的Ta的Tm，其中寡核苷酸序列
的至少一个包含至少一个硫代磷酸酯基团，所述至少一种引物包含至少一个
\t未标记的加尾的引物，未标记的加尾的引物具有尾部区域，该尾部区域包含
互补于第二单标记的寡核苷酸序列的寡核苷酸序列的寡核苷酸序列，第一单
标记的寡核苷酸序列是PCR过程中一旦产生互补于第一单标记的寡核苷酸
序列的序列就可由其起始DNA合成的引物，因此第二单标记的寡核苷酸序
列不再能够与第一单标记的寡核苷酸序列杂交，从而产生可测量的信号；
b...
【专利技术属性】
技术研发人员：菲利普·史蒂文·鲁宾逊，约翰·霍尔梅，尼沙·吉恩，
申请(专利权)人：LGC基因组学有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB
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