本发明专利技术公开了一种大麦Waxy基因SNP突变的PCR-CTPP标记引物，包括外引物G3935-TWF2和G3935-TWR2；内引物G3935-TNF2和G3935-TNR2；本发明专利技术还公开了一种大麦Waxy基因SNP突变的PCR-CTPP标记方法，包括以下步骤：采用CTAB法提取待检测植株基因组DNA；利用提取的DNA为模板进行特异性PCR扩增；将PCR扩增产物进行电泳，对基因型进行判定。本发明专利技术使用四个引物结合一次PCR和电泳，便能在大麦群体中快速且经济地筛选出携带G3935突变为T位点的糯大麦材料，并能作为一种追踪标记在大麦苗期提前对杂交分离群体进行鉴定，提高分子标记辅助选择育种效率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物生物
，具体涉及一种大麦Waxy基因SNP突变的PCR-CTPP标记引物，本专利技术还涉及一种大麦Waxy基因SNP突变的PCR-CTPP标记方法。
技术介绍
大麦(Hordeum vulgare L.)是全球第四大谷类作物。淀粉是大麦籽粒中的主要成分，通常由直链淀粉(20～30％)和支链淀粉(70～80％)组成。直链淀粉与支链淀粉的比例及其特性是影响大麦等谷类作物籽粒终端利用价值的重要因素。Waxy基因编码颗粒结合型淀粉合成酶(granule-bound starch synthase I，GBSSI)，主要负责直链淀粉的合成。大麦的Waxy基因包含12个外显子和11个内含子，其编码的GBSSI蛋白含有463个氨基酸。Waxy基因的突变通常会影响直链淀粉合成。无直链淀粉或低直链淀粉的大麦通常被称为糯大麦，经碘染实验后籽粒截面呈红色，而普通大麦为黑色。目前已发现大麦Waxy基因5’非编码区(5’UTR)中一段403bp的缺失导致mRNA、GBSSI蛋白表达水平和直链淀粉含量急剧降低。此外，大麦Waxy基因外显子上的三个SNP突变直接抑制籽粒中直链淀粉合成。其中位于外显子10中核苷酸序列第3935位的G3935(核苷酸序列参照X07931，Genebank)突变为T，导致GBSSI蛋白多肽链的第513位的甘氨酸(Gly)突变为色氨酸(Trp)。513th Gly位于GBSSI的糖基转移酶结构域(glycosyltranferase domain，GT-1)中，在许多生物的糖原合酶类蛋白中非常保守，所以该位点的突变可能使GBSSI失活从而不能合成直链淀粉。开发一种分子标记对该SNP位点进行筛选可提高分子标记辅助育种的效率及在优良糯大麦培育过程中的发挥重要作用。目前对于SNP的检测技术主要有限制性片段长度多态性分析(RFLP)、等位基因特异性PCR(AS-PCR)、寡核苷酸连接分析(OLA)等方法。裂解扩增多态性序列分析(cleaved amplified polymorphic sequence analysis，CAPS)因为操作简便目前广泛用于植物和微生物的SNP检测、基因标记和连锁构图。针对大麦Waxy基因G3935突变为T而使原有的SexAI酶切位点消失，目前已报道了一对CAPS标记对该SNP位点进行筛选，但CAPS标记需进行PCR扩增、酶切、电泳分离酶切片段，检测费时且价格昂贵。PCR-CTPP(Tetra-primer amplification refractory mutation system PCR，Tetra-primer ARMS PCR)又称四引物扩增受阻突变体系PCR。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种大麦Waxy基因SNP突变的PCR-CTPP标记引物。本专利技术的另一目的是提供一种大麦Waxy基因SNP突变的PCR-CTPP标记方法，该方法基于PCR-CTPP的四个引物的核苷酸序列，以及该引物在检测携带G3935突变为T位点的糯大麦(TT型)、携带G3935的普通大麦(GG型)及同时含有G3935和突变T位点的普通大麦杂合型(GT型)的用法。本专利技术所采用的第一技术方案是，一种大麦Waxy基因SNP突变的PCR-CTPP标记引物，所述引物序列如下：外引物G3935-TWF2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体为：5’-CGGGAAGAAGAAGTTTGAGA-3’；外引物G3935-TWR2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体为：5’-CACTACAACAAGCGGCTATCT-3’；内引物G3935-TNF2的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体为：5’-TCGTGGAGGGCAAGATC-3’；内引物G3935-TNR2的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体为：5’-GCTGAGGCGGCCCATGTGGAATC-3’，上述引物序列中带下划线的碱基为引入的错配碱基，加框的碱基为要检测的突变碱基。本专利技术所采用的第二技术方案是，一种大麦Waxy基因SNP突变的PCR-CTPP标记方法，利用上述的标记引物，具体按照以下步骤实施：步骤1、采用CTAB法提取大麦品种基因组DNA；步骤2、利用步骤1中提取的基因组DNA为模板进行特异性PCR扩增；步骤3、将PCR扩增产物进行电泳，对基因型进行判定。本专利技术的特点还在于，步骤1中采用CTAB法提取待检测植株基因组DNA具体按照以下步骤实施：步骤1.1、取100mg大麦的幼嫩叶片于液氮中研磨成细粉状后加入预热至65℃的CTAB提取液700ul，混匀；65℃水浴40min，其间轻摇混匀数次；步骤1.2、冷却至室温后加入1mL体积比为24∶1的氯仿∶异戊醇，轻摇混匀10min，13000rpm离心10min；步骤1.3、取上清液，重复步骤1.2，取上清液加入700ul预冷至-20℃的异丙醇，轻摇混匀后于-20℃中静置2小时；步骤1.4、13000rpm离心15min，弃上清，用75％乙醇洗涤沉淀3次。晾干后加入100ul ddH2O溶解。步骤2中特异性PCR反应体系如下：步骤2中的PCR反应程序为：PCR反应在GenePCR System 9700型PCR仪中进行。步骤3中将PCR扩增产物进行电泳，对基因型进行判定具体按照以下步骤实施：将扩增产物于1％琼脂糖凝胶电泳分离，100V恒定电泳40min后EB染色检测，如果扩增产物为861bp和552bp两种片段，显示标记个体基因型为TT型，为糯青稞，电泳条带为两条带；如果扩增产物为872bp和350bp两种片段，显示标记个体基因型为GG型，为普通青稞，电泳条带为两条带；如果扩增产物为861/872bp、552bp和350bp三条带；显示标记个体基因型为GT型，为普通青稞杂合型，电泳条带为三条带。CTAB提取液为2％CTAB；1.4M NaCl，0.1M Tris-HCl，pH 8.0，0.1M EDTA，pH 8.0。本专利技术的有益效果是：采用本专利技术的四个引物，结合一次PCR和电泳，便可以在大麦群体中快速且经济地筛选出携带G3935突变为T位点的糯大麦材料，并且可以作为一种追踪标记在大麦苗期提前对杂交分离群体进行鉴定，提高分子标记辅助选择育种效率。本专利技术是在突变位点附近设计两个外引物和两个内引物，内引物的3’终末端为突变位点，同时在内引物本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种大麦Waxy基因SNP突变的PCR‑CTPP标记引物，其特征在于，所述引物序列如下：外引物G3935‑TWF2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体为：5’‑CGGGAAGAAGAAGTTTGAGA‑3’；外引物G3935‑TWR2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体为：5’‑CACTACAACAAGCGGCTATCT‑3’；内引物G3935‑TNF2的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体为：5’‑TCGTGGAGGGCAAGATC‑3’；内引物G3935‑TNR2的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体为：5’‑GCTGAGGCGGCCCATGTGGAATC‑3’，上述引物序列中带下划线的碱基为引入的错配碱基，加框的碱基为要检测的突变碱基。
【技术特征摘要】
1.一种大麦Waxy基因SNP突变的PCR-CTPP标记引物，其特征在
于，所述引物序列如下：
外引物G3935-TWF2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体为：5’-
CGGGAAGAAGAAGTTTGAGA-3’；外引物G3935-TWR2的核苷酸序列
如SEQ ID No.2所示，具体为：5’-CACTACAACAAGCGGCTATCT-3’；
内引物G3935-TNF2的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体为：
5’-TCGTGGAGGGCAAGATC-3’；内引物G3935-TNR2的核苷酸序列如
SEQ ID No.4所示，具体为：5’-GCTGAGGCGGCCCATGTGGAATC-3’，
上述引物序列中带下划线的碱基为引入的错配碱基，加框的碱基为要检
测的突变碱基。
2.一种大麦Waxy基因SNP突变的PCR-CTPP标记方法，其特征在
于，利用权利要求1所述的标记引物，具体按照以下步骤实施：
步骤1、采用CTAB法提取大麦品种基因组DNA；
步骤2、利用步骤1中提取的基因组DNA为模板进行特异性PCR
扩增；
步骤3、将PCR扩增产物进行电泳，对基因型进行判定。
3.根据权利要求2所述的大麦Waxy基因SNP突变的PCR-CTPP标
记方法，其特征在于，所述步骤1中采用CTAB法提取待检测植株基因
组DNA具体按照以下步骤实施：
步骤1.1、取100mg大麦的幼嫩叶片于液氮中研磨成细粉状后加入
预热至65℃的CTAB提取液700ul，混匀；65℃水浴40min，其间轻摇
混匀数次；
步骤1.2、冷却至室温后加入1mL体积比为24：1的氯仿：异戊醇，
轻摇混匀10mi...
【专利技术属性】
技术研发人员：潘志芬，李俏，余懋群，邓光兵，龙海，
申请(专利权)人：中国科学院成都生物研究所，
类型：发明
国别省市：四川;51
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