2’-O-MOE-3’-H-硫代磷酸酯核苷单体及其合成方法技术

本发明专利技术公开了2’‑O‑MOE‑3’‑H‑二硫代磷酸核糖核苷和2’‑O‑MOE‑3’‑H‑单硫代磷酸核糖核苷以及前体化合物，其制备方法及应用，属于糖化学及药物化学领域。其具有通式1、通式2和通式3所示结构：

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于核苷化学及药物化学领域，具体涉及2’-O-甲氧乙基核苷及其3’-H-二硫代磷酸酯和3’-H-单硫代磷酸酯衍生物，以及相应的制备方法。
技术介绍
RNAi技术作为后基因组时代的一种下调基因表达的工具被广泛用作调节基因功能以及疾病治疗的重要手段。小干扰RNA(siRNA)与信使RNA(mRNA)中的同源序列互补结合，导致mRNA失去功能是RNAi的关键步骤。但由于天然RNA在生物体内极易降解，因此改善天然RNA的稳定性是现在siRNA全面走向应用所面临的主要问题。研究表明，siRNA中糖环的2’-羟基对基因沉默活性没有显著作用，因此对2’-羟基的封闭或替换作为一种重要的方法被广泛用于siRNA的改性研究中，如通过2’-甲氧基或2’-氟取代2’-羟基可显著改善siRNA的酶解稳定性(ChemMedChem,2009,5,328；Mol.Ther.,2006,13,644)。另外用一个硫原子或一个硼基团取代部分磷酸酯上一个非桥氧原子得到单硫代磷酸酯(PS)或硼代磷酸酯也能增加磷酸桥键抵抗核酸酶的能力，不同程度地改善siRNA的稳定性。但是单硫改性和硼改性后的磷原子都具有了手性，进而产生不易拆分的非对映异构体的混合物，使得siRNA的生物化学、生物物理和生物学性质多样化而不稳定。解决此问题的一种有效方法是合成非手性磷的改性RNA。如果用硫取代磷酸酯的全部两个非桥氧原子可以得到核苷酸间二硫代磷酸酯(PS2)键合的RNA(PS2-RNA，如下所示)。并且PS2-RNA和天然的磷酸二酯键合的RNA相同，PS2-RNA的磷原子也是非手性的。PS2-RNA是天然RNA的生物电子等排体，具有和正常RNA相似的其他生物化学和生物物理性能。另外，对PS2-siRNA的活性研究表明，PS2取代不仅提高稳定性，还可提高siRNA的基因沉默活性，并具有较低的细胞毒性(ACS Chem.Biol.2012,7,1214)。因此通过改造磷酸酯骨架，合成二硫代磷酸酯核苷单体具有很大的应用价值。因此用PS2和2’-取代双重改性的核苷酸单元取代siRNA中的部分核苷酸单元制备PS2-siRNA的研究越来越引起人们的重视。传统合成PS2-RNA使用硫代磷酰亚胺法，而硫代磷酰亚胺单体(三价磷)极不稳定，储存稳定性差，不利于大规模使用。因此，发现用于合成PS2-siRNA的高稳定性的合成单体及合成方法是当务之急。众所周知，五价磷化合物比三价磷化合物的稳定性高。因此本专利技术设计合成了可用于H-硫代磷酸酯法合成新型PS2-siRNA的两类磷为五价的硫代磷酸酯核苷单体，即：2’-O-MOE-3’-H-单硫代磷酸核苷和2’-O-MOE-3’-H-二硫代磷酸核苷。该专利技术对于开发有使用价值的RNAi药物有非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供可用于改性PS2-RNA合成的2’-O-MOE-3’-H-单硫代磷酸核苷单体和2’-O-MOE-3’-H-二硫代磷酸核苷单体；另一目的在于提供其制备方法。为实现此目的，本专利技术选取三种核糖核苷为原料，通过化学修饰分别得到2’-甲氧乙基(MOE,methoxylethyl)保护的尿嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤核糖核苷；再通过适当的选择性保护，对3’-羟基分别进行H-二硫代磷酸化或H-单硫代磷酸化得到相应的2’-O-MOE-3’-H-二硫代磷酸核糖核苷(通式一)或2’-O-MOE-3’-H-单硫代磷酸核糖核苷(通式二)：其中：B代表碱基，分别为尿嘧啶，胞嘧啶，腺嘌呤，鸟嘌呤，N4-乙酰基胞嘧啶，N4-苯甲酰基胞嘧啶，N6-苯甲酰基腺嘌呤，N6-乙酰基腺嘌呤，N2-异丁酰基鸟嘌呤，N2-乙酰基鸟嘌呤，N2-苯甲酰基鸟嘌呤；所述碱基B优选尿嘧啶，4-乙酰基胞嘧啶，6-苯甲酰基腺嘌呤，2-异丁酰基鸟嘌呤。其中R代表氢，三苯甲基(Tr)，4-甲氧基三苯甲基(MMTr)，4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMTr，DMT)；所述R优选4,4’-二甲氧基三苯甲基。制备上述通式一所示化合物的方法是：将1,2,4-三氮唑和有机碱溶于有机溶剂中，置于冰浴中氮气保护下搅拌，加入PCl3，搅拌，然后滴加通式三所示化合物溶液，滴加完毕移去冰浴常温搅拌，然后向反应体系中通入H2S气体，反应结束后吹氮气将多余的H2S移除，浓缩反应液得黄色固体，再用二氯甲烷和饱和的碳酸氢三乙胺盐萃取分层，合并油相，干燥过夜，柱分离得通式1所示化合物。其中，所说的有机碱是二异丙基乙胺，三乙胺，二乙胺，吗啉，N-甲基吗啉，吡啶，4-二甲胺基吡啶中的一种或两种。其中，所说的有机溶剂是乙腈，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，二甲亚枫(DMSO)，二氯甲烷，氯仿，四氢呋喃中的一种。制备上述通式二所示化合物的方法是：将通式三所示化合物与次磷酸三乙胺盐混合用无水吡啶减压带水两次，用无水吡啶溶解并氮气保护下置于冰浴中搅拌，加入偶合试剂反应，然后移除冰浴，加入升华硫搅拌反应,TLC监测反应完毕后加饱和的碳酸氢三乙胺盐溶液淬灭反应。减压蒸除溶剂得油状物，然后用二氯甲烷与碳酸氢三乙胺盐水溶液萃取分层，再用二氯甲烷萃取，合并有机层，干燥过夜，柱分离得通式二所示化合物。其中，所说的偶合试剂是氯磷酸二苯酯、特戊酰氯、氯磷酸二(2,6-二甲基苯)酯、氯磷酸二乙酯中的一种。制备上述通式三所示的嘧啶类核苷化合物的方法是：(1)首先用碳酸二苯酯和无机碱在极性有机溶剂中加热处理尿苷得到2,2’-缩水-1-β-D-阿糖尿苷。所说的无机碱是碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾和碳酸氢钾中的一种或两种；所说的极性有机溶剂是N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜中的一种或两种；所说的加热指反应温度在50-150℃。(2)用有机溶剂稀释2-甲氧乙氧基金属盐，加入2,2’-缩水-1-β-D-阿糖尿苷，加热回流，柱分离得到2’-O-甲氧乙基尿苷(2’-O-MOE-尿苷)。所说的金属盐是镁盐或铝盐，由镁粉或金属铝粉与无水2-甲氧基乙醇加热回流制备；所用有机溶剂为2-甲氧基乙醇或乙二醇二甲醚或二者的混合溶液；回流时间为5-60小时。(3)2’-O-甲氧乙基尿苷通过糖环羟基的临时保护、嘧啶4位氧转化为氨基得到2’-O-甲氧乙基胞苷；选择性氨基酰化得到2’-O-甲氧乙基-N4-酰基胞苷。所说的羟基临时保护指采用三甲基氯硅烷使羟基硅烷化，待转化完成后加水去除三甲基硅基；嘧啶4位氧转化为氨基通过1,2,4-三氮唑/三氯氧磷/氨水或三氟乙酸酐/4-硝基苯酚/氨水等方法实现；选择性氨基酰化同样采用三甲基硅烷临时保护羟基，通过酰氯或酸酐酰化氨基来实现。(4)2’-O-甲氧乙基尿苷或2’-O-甲氧乙基-N4-酰基胞苷与三苯甲基氯或甲氧基取代的三苯甲基氯反应，选择性保护5’-羟基得到通式三所示的选择性保护的嘧啶核苷。制备上述通式3所示的嘌呤类核苷化合物的方法是：(1)将腺苷或2-氨基腺苷在碱的存在下与2-溴乙基甲基醚作用，柱层析分离得到2’-O-MOE-腺苷或2’-O-MOE-2-氨基腺苷。2’-O-MOE-腺苷选择性氨基酰化生成2’-O-MOE-N6-酰基腺苷。其中，所述的碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾、氢化钠、氢化钾、叔丁醇钾和叔丁醇钠的一种。(2)2’-O-MOE-2-氨基腺苷经选择性酰基保护得2’-O本文档来自技高网...

【技术保护点】
2’‑O‑MOE‑3’‑H‑二硫代磷酸核糖核苷或2’‑O‑MOE‑3’‑H‑单硫代磷酸核糖核苷，其特征在于，分别具有通式一或通式二所示结构：       通式一                      通式二其中：B代表碱基，分别为尿嘧啶，胞嘧啶，腺嘌呤，鸟嘌呤，N4‑乙酰基胞嘧啶，N4‑苯甲酰基胞嘧啶，N6‑苯甲酰基腺嘌呤，N6‑乙酰基腺嘌呤，N2‑异丁酰基鸟嘌呤，N2‑乙酰基鸟嘌呤，N2‑苯甲酰基鸟嘌呤；其中R代表氢，三苯甲基，4‑甲氧基三苯甲基，4,4’‑二甲氧基三苯甲基。

【技术特征摘要】
1.2’-O-MOE-3’-H-二硫代磷酸核糖核苷或2’-O-MOE-3’-H-单硫代磷酸核糖核苷，其特征在于，分别具有通式一或通式二所示结构： 通式一 通式二其中：B代表碱基，分别为尿嘧啶，胞嘧啶，腺嘌呤，鸟嘌呤，N4-乙酰基胞嘧啶，N4-苯甲酰基胞嘧啶，N6-苯甲酰基腺嘌呤，N6-乙酰基腺嘌呤，N2-异丁酰基鸟嘌呤，N2-乙酰基鸟嘌呤，N2-苯甲酰基鸟嘌呤；其中R代表氢，三苯甲基，4-甲氧基三苯甲基，4,4’-二甲氧基三苯甲基。2.如权利要求1所述的2’-O-MOE-3’-H-二硫代磷酸核糖核苷或2’-O-MOE-3’-H-单硫代磷酸核糖核苷，其特征在于，所述碱基B优选尿嘧啶，N4-乙酰基胞嘧啶，N6-苯甲酰基腺嘌呤，N2-异丁酰基鸟嘌呤；所述R优选4,4’-二甲氧基三苯甲基。3.制备权利要求1所述2’-O-MOE-3’-H-二硫代磷酸核糖核苷的方法，其特征在于，通过如下方法实现：将1,2,4-三氮唑和有机碱溶于有机溶剂中，置于冰浴中氮气保护下搅拌，加入PCl3搅拌，然后滴加通式三所示化合物溶液，滴加完毕移去冰浴常温搅拌，然后向反应体系中通入H2S气体，反应完毕，吹氮气将多余的H2S移除，浓缩反应液得固体，再用二氯甲烷和饱和的碳酸氢三乙胺盐萃取分层，合并油相，干燥过夜，柱分离得通式一所示化合物通式三所述的有机碱是二异丙基乙胺，三乙胺，二乙胺，吗啉，N-甲基吗啉，吡啶，4-二甲胺基吡啶中的一种或两种；所述的有机溶剂是乙腈，N,N-二甲基甲酰胺，二甲亚枫，二氯甲烷，氯仿，四氢呋喃中的一种。4.制备权利要求1所述2’-O-MOE-3’-H-单硫代磷酸核糖核苷的方法，其特征在于，通过如下方法实现：将通式三所示化合物与次磷酸三乙胺盐混合用无水吡啶减压带水两次，无水吡啶溶解并氮气保护下置于冰浴中搅拌，加入偶合试剂反应，然后移除冰浴，加入升华硫搅拌反应,TLC监测反应完毕后加饱和碳酸氢三乙胺盐溶液淬灭反应；减压蒸除溶剂得油状物，然后用二氯甲烷与碳酸氢三乙胺盐水溶液萃取分层，再用二氯甲烷萃取，合并有机层，干燥过夜，柱分离得通式二所示化合物；通式三其中，所说的偶合试剂是氯磷酸二苯酯、特戊酰氯、氯磷酸二（2,6-二甲基苯）酯、氯磷酸二乙酯中的一种。5.2’-O-MOE-核糖核苷化合物，其特征在于，具有通式三所示结构：通式三其中：B代表碱基，分别为尿嘧啶，胞嘧啶，腺嘌呤，鸟嘌呤，N4-乙酰基胞嘧啶，N4-苯甲酰基胞嘧啶，N6-苯甲酰基腺嘌呤，N6-乙酰基腺嘌呤，N2-异丁酰基鸟嘌呤，N2-乙酰基鸟嘌呤，N2-苯甲酰基鸟嘌呤；其中R代表氢，三苯甲基，4-甲氧基三苯甲基，4,4’-二甲氧基三苯甲基。6.制备权利要求5所述2’-O-MOE-核糖核苷化合物的方法，其特征在于，B代表尿嘧啶时通过如下方法实现：首先用碳酸二苯酯和无机碱在极性有机溶剂中加热处理尿苷得到2,2’-缩水-1-β-D-阿糖尿苷，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘丰五，朱世卿，韩巍巍，杨宪斌，刘宏民，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：河南;41