水解探针制造技术

提供了用于检测和定量核酸的方法和组合物。在一个实施方案中，使样品和与靶核酸第一区互补的引物以及与所述第一区下游的靶核酸第二区互补的探针在适于靶核酸与所述引物和所述探针杂交的条件下相接触。该实施方案中的探针包含荧光团并且与固体支持物相连接。用具有外切核酸酶活性的核酸聚合酶切割杂交的探针以从所述固体支持物释放报道子。然后通过检测来自固体支持物上报道子之信号的降低来检测靶核酸的存在并任选地进行定量。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】水解探针专利技术背景本申请要求2011年9月29日提交的美国临时专利申请序列号61 / 540, 868的优先权。上述引用的公开内容通过引用整体并入本文。1.
本专利技术一般性地涉及分子生物学领域。更具体地，本专利技术涉及核酸的检测和定量。2.相关领域描述聚合酶链反应(PCR)是一种分子生物学技术，其通常在医学和生物学研究实验室中用于多种任务，例如遗传性疾病的检测、遗传指纹的鉴定、感染性疾病的诊断、基因的克隆、亲子鉴定和DNA计算。PCR已经因其无可比拟的扩增能力和精确性而被分子生物学家公认为选择用于核酸检测的方法。DNA检测通常在PCR反应的终点或平台期进行，使得难以对起始模板进行定量。实时PCR或动力学PCR通过随着反应进行记录扩增子浓度来提高终点PCR分析能力。扩增子浓度最常通过与所扩增靶标相关的荧光信号变化来记录。实时PCR相对于终点检测来说的优势还在于污染受到限制，因为其可以在封闭的系统中进行。其他优点包括较高的灵敏度、动态范围、速度以及较少的所需程序。 若干测定化学已被用于实时PCR检测方法中。这些测定化学包括使用双链DNA结合染料、双重标记寡核苷酸(例如发夹引物和发夹探针)。其他化学包括基于外切核酸酶的探针(例如水解探针)。多种PCR和实时PCR方法公开于美国专利N0.5，656，493、5，994，056,6,174，670,5, 716，784,6, 030，787,6, 174，670 和 7，955，802 中，其通过引用并入本文。许多实时PCR技术的缺点是有限的多重(multiplexing)能力。使用游离在溶液中的报道子(reporter)突光染料(fiuorochrome)的实时PCR技术在多重反应的每个测定中需要光谱不同的荧光染料。例如，设计为检测4个靶序列的多重反应会需要能够通过光谱差异来区分4种不同的自由漂浮(free floating)荧光染料的仪器，不包括对照。这些要求不仅限制实际多重能力，还提高成本，因为这样的仪器通常需要多个激光器和过滤器。
技术实现思路
在某些实施方案中，提供了检测核酸的方法。在一个实施方案中，本专利技术提供了用于在样品中检测祀核酸的方法，其包括:(a)使样品和与祀核酸第一链上第一区互补的第一靶特异性引物以及与所述第一区下游的靶核酸第一链上第二区互补的靶特异性探针在适于靶核酸与靶特异性引物以及靶特异性探针杂交的条件下相接触，其中所述靶特异性探针包含报道子并且与固体支持物相连接；(b)用具有外切核酸酶活性的核酸聚合酶切割杂交的靶特异性探针，以从固体支持物释放报道子；和(C)通过检测来自固体支持物上报道子之信号的变化来检测靶核酸。可以进行该方法以检测单一靶标或者可以包括另外的引物和探针以在多重测定中检测多种不同的靶核酸。例如，在一个实施方案中，该方法还包括:(a)使样品和与第二靶核酸第一链上第一区互补的至少第二靶特异性引物以及与所述第一区下游的第二靶核酸第一链上第二区互补的至少第二靶特异性探针在适于第二靶核酸与第二靶特异性引物以及第二靶特异性探针杂交的条件下相接触，其中第二靶特异性探针包含第二报道子并且与第二固体支持物相连接；(b)用具有外切核酸酶活性的核酸聚合酶切割第二杂交的靶特异性探针，以从第二固体支持物释放第二报道子；和(C)通过检测来自第二固体支持物上第二报道子之信号的变化来检测第二靶核酸。第一固体支持物与第二固体支持物可以是同一固体支持物上的空间上离散的位置，例如平面阵列上的空间上离散的位置，或者第一固体支持物与第二固体支持物可以是物理上分离的(例如珠阵列)。在一种多重性方法中，不同的靶特异性探针相连的报道子可以是相同的，因为不同的靶特异性探针可以通过它们所连接的固体支持物来区分。但是，在一些实施方案中，使用两种或更多种不同的报道子。另一个实施方案提供了用于在样品中检测多种靶核酸之存在或不存在的多重性方法，其包括:(a)使样品与多种引物/探针对以及靶特异性探针在适于靶核酸与第一靶特异性引物以及靶特异性探针杂交的条件下相接触，每种引物/探针对包含与多种靶核酸之一的第一链上第一区互补的靶特异性引物，所述靶特异性探针与所述第一区下游的多种靶核酸之一的第一链上第二区互补，其中所述靶特异性探针包含报道子并且与固体支持物相连接；(b)用具有外切核酸酶活性的核酸聚合酶切割杂交的靶特异性探针，以从固体支持物释放报道子；和(C)检测来自固体支持物上报道子的信号，从而信号的变化表明靶核酸的存在。在某些方面中，多种引物/探针对的每种不同的靶特异性探针与一个固体上的空间上离散的位置相连接。在另一些方面中，多种引物/探针对的每种不同的靶特异性探针与不同的固体支持物相连接。在一些实施方案中，该方法还可以包括:使样品和与多种靶核酸第二链上的区域互补的多种不同第二靶特异性引物相接触；和进行多个聚合酶链反应循环。多个聚合酶链 反应循环可以在循环之间进行或不进行用于除去自由漂浮报道子的洗涤步骤的情况下进行。信号的变化可以是信号的降低或增强，这取决于所用报道子的类型。例如，如果报道子是荧光团，则将在靶核酸的存在下观察到的信号变化是荧光信号的降低。另一方面，如果报道子是突光团-淬灭剂对(f luorphore and quencher pair),则在存在祀核酸时,突光团与淬灭剂的分离导致荧光信号增强。术语“上游’’和“下游’’在本文中与由靶特异性引物引发的新生链之合成相关地使用。因此，例如，与引物与之杂交的靶核酸区“下游”的靶核酸区杂交的靶特异性探针位于引物的3’并且将处于聚合酶以5’至3’方向延伸所述引物的路径中。在某些方面中，该方法还包括使样品和与靶核酸第二链上的区域互补的第二靶特异性引物相接触。所述第一靶特异性引物和所述第二靶特异性引物定位在靶核酸的相反链上以使得可以通过PCR来扩增靶核酸的区域。在某些方面中，该方法包括进行多个扩增循环。典型的扩增循环具有三个期:变性期、引物退火期和引物延伸期，每个期在不同的温度下进行。也可以进行2-阶段PCR，其中每个循环仅使用两个温度；例如95°C和60°C。因此，在某些方面中，该方法还包括:使靶核酸与靶特异性引物以及靶特异性探针重复杂交；用具有外切核酸酶活性的核酸聚合酶延伸靶特异性引物以使第一靶特异性引物的延伸导致杂交的靶特异性探针的切割和从固体支持物释放报道子；和检测来自固体支持物上报道子之信号的变化。在某些实施方案中，重复扩增循环至少直至可以从背景噪声中区分出信号变化。但是，如果样本中不存在特定靶核酸，那么无论进行多少次循环，从背景噪声中都不应可区分出信号变化。在反应中包括适当的阳性对照和阴性对照可以有助于确定样品中不存在特定靶核酸。本领域普通技术人员会知晓如何选择适当的阳性对照和阴性对照用于特定测定。在一些实施方案中，在用具有外切核酸酶活性的核酸聚合酶延伸靶特异性引物以切割杂交的靶特异性探针并且从固体支持物释放报道子之前检测来自固体支持物上报道子的信号。在一些实施方案中，来自固体支持物上的报道子的信号的变化包括在进行多个聚合酶链反应循环之前和之后检测信号。在一些实施方案中，来自固体支持物上报道子之信号的变化包括在两个或更多个扩增循环之间检测信号。在另一些实施方案中，来自固体支持物上报道子之信号的变化包括仅在进行多个聚本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于在样品中检测靶核酸的方法，其包括：(a)使样品和与靶核酸第一链上第一区互补的第一靶特异性引物以及与所述第一区下游的所述靶核酸第一链上第二区互补的靶特异性探针在适于所述靶核酸与所述第一靶特异性引物以及所述靶特异性探针杂交的条件下相接触，其中所述靶特异性探针包含报道子并且与固体支持物相连接；(b)用具有外切核酸酶活性的核酸聚合酶切割杂交的靶特异性探针以从所述固体支持物释放所述报道子；和(c)通过检测来自所述固体支持物上所述报道子之信号的变化来检测所述靶核酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.09.29 US 61/540,8681.一种用于在样品中检测靶核酸的方法，其包括: (a)使样品和与靶核酸第一链上第一区互补的第一靶特异性引物以及与所述第一区下游的所述靶核酸第一链上第二区互补的靶特异性探针在适于所述靶核酸与所述第一靶特异性引物以及所述靶特异性探针杂交的条件下相接触，其中所述靶特异性探针包含报道子并且与固体支持物相连接； (b)用具有外切核酸酶活性的核酸聚合酶切割杂交的靶特异性探针以从所述固体支持物释放所述报道子；和 (C)通过检测来自所述固体支持物上所述报道子之信号的变化来检测所述靶核酸。2.权利要求1所述的方法，其中所述第一靶特异性引物和所述靶特异性探针与所述靶核酸上的相邻序列杂交。3.权利要求1所述的方法，其中所述第一靶特异性引物和所述靶特异性探针与所述靶核酸上的非相邻序列杂交。4.权利要求1所述的方法，其还包括用所述具有外切核酸酶活性的核酸聚合酶延伸所述第一靶特异性引物。5.权利要求1所述的方法，其中所述固体支持物是编码的珠。6.权利要求1所述的方法，其中所述报道子是荧光团。7.权利要求6所述 的方法，其中所述荧光团连接在所述靶特异性探针的5’端。8.权利要求6所述的方法，其中所述信号的变化是荧光信号的降低。9.权利要求1所述的方法，其中所述报道子是荧光团-淬灭剂对。10.权利要求9所述的方法，其中所述信号的变化是荧光信号的增强。11.权利要求1所述的方法，其还包括检测来自与固体支持物相连接的非杂交探针上报道子的参考信号。12.权利要求11所述的方法，其中所述非杂交探针连接至与所述靶特异性探针相连接的同一固体支持物上的空间上离散的位置。13.权利要求11所述的方法，其中所述非杂交探针连接至与所述靶特异性探针相连接的固体支持物不同的固体支持物。14.权利要求13所述的方法，其中所述不同的固体支持物是不同的编码的珠。15.权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸是第一靶核酸，所述报道子是第一报道子，所述固体支持物是第一固体支持物，并且所述方法还包括: (a)使所述样品和与第二靶核酸第一链上第一区互补的第二靶特异性引物以及与所述第一区下游的所述第二靶核酸第一链上第二区互补的第二靶特异性探针在适于所述第二靶核酸与所述第二靶特异性引物以及所述第二靶特异性探针杂交的条件下相接触，其中所述第二靶特异性探针包含第二报道子并且与第二固体支持物相连接； (b)用所述具有外切核酸酶活性的核酸聚合酶切割第二杂交的靶特异性探针以从所述第二固体支持物释放所述第二报道子；和 (c)通过检测来自所述第二固体支持物上所述第二报道子之信号的变化来检测所述第二靶核酸。16.权利要求15所述的方法，其中所述第一固体支持物和所述第二固体支持物是一个固体支持物上的空间上离散的位置。17.权利要求15所述的方法，其中所述第一固体支持物与所述第二固体支持物是物理上分离的。18.权利要求15所述的方法，其中所述第一报道子与所述第二报道子是相同的。19.权利要求15所述的方法，其中所述第一报道子与所述第二报道子是不同的。20.权利要求11所述的方法，其还包括对荧光的随时间变化进行归一化。21.权利要求1所述的方法，其还包括使所述样品和与所述靶核酸的第二链上的区域互补的第二靶特异性引物相接触。22.权利要求21所述的方法，其还包括进行多个聚合酶链反应循环。23.权利要求22所述的方法，其中所述多个聚合酶链反应循环在没有用于在循环之间除去自由漂浮荧光团的洗涤步骤的情况下进行。24.权利要求22所述的方法，其中检测来自所述固体支持物上所述报道子之信号的变化包括在进行所述多个聚合酶链反应循环之前和之后检测所述信号。25.权利要求22所述的方法，其中检测来自所述固体支持物上所述报道子之信号的变化包括仅在进行所述多个聚合酶链反应循环之后检测所述信号。26.权利要求25所述的方法，其还包括将所检测的来自所述固体支持物上所述报道子的信号与以下预定比例进行比较:所述固体支持物上所述报道子的信号与来自与固体支持物相连接的非杂交探 针上报道子的参考信号的预定比例。27.权利要求22所述的方法，其还包括对所述样品中所述靶核酸的量进行定量。28.权利要求27所述的方法，其中对所述样品中所述核酸靶的量进行定量包括使用标准曲线。29.权利要求27所述的方法，其中对所述样品中所述核酸靶的量进行定量包括确定所述革El核酸的相对量。30.权利要求27所述的方法，其中对所述样品中所述核酸靶的量进行定量包括使用终点定量。31.权利要求27所述的方法，其中对所述样品中所述核酸靶的量进行定量包括通过将所述信号相对于背景可检测时的PCR循环数与存在的靶标的量相关联来确定所述核酸靶的量。32.权利要求1所述的方法，其还包括在切割所述杂交的靶特异性探针之前检测来自所述固体支持物上所述报道子的信号。33.权利要求1所述的方法，其还包括所述靶特异性探针与所述固体支持物之间的接头。34.一种用于在样品中检测靶核酸的方法，其包括: (a)使样品和与靶核酸第一链上第一区互补的第一靶特异性引物以及与所述第一区下游的所述靶核酸第一链上第二区互补的靶特异性探针在适于所述靶核酸与所述第一靶特异性引物以及所述靶特异性探针杂交的条件下相接触，其中所述靶特异性探针包含在其5’或3’端的标签，还包含报道子； (b)用具有外切核酸酶活性的核酸聚合酶切割杂交的靶特异性探针以从所述标签释放所述报道子； (c)使所述标签与固定在固体支持物上的互补性抗标签杂交；和(d)通过检测来自所述固体支持物上所述报道子之信号的降低来检测所述靶核酸。35.权利要求34所述的方法，其中所述第一靶特异性引物和所述靶特异性探针与所述靶核酸上的相邻序列杂交。36.权利要求34所述的方法，其中所述第一靶特异性引物和所述靶特异性探针与所述靶核酸上的非相邻序列杂交。37.权利要求34所述的方法，其还包括用所述具有外切酶活性的核酸聚合酶延伸所述第一靶特异性引物。38.权利要求34所述的方法，其还包括:在切割所述杂交的靶特异性探针以从所述标签释放所述报道子分子之前使所述靶特异性探针与固定在所述固体支持物上的抗标签杂交；和检测来自所述固体支持物上所述报道子的信号。39.权利要求34所述的方法，其中所述报道子是生物素或荧光团。40.权利要求34所述的方法，其中所述固体支持物是编码的珠。41.权利要求34所述的方法，其中所述靶核酸是第一靶核酸，所述报道子是第一报道子，所述标签是第一标签，所述固体支 持物是第一固体支持物，并且所述方法还包括: (a)使所述样品和与第二靶核酸第一链上第一区互补的第二靶特异性引物以及与所述第一区下游的所述第二靶核酸第一链上第二区互补的第二靶特异性探针在适于所述第二靶核酸与所述第二靶特异性引物以及所述第二靶特异性探针杂交的条件下相接触，其中所述第二靶特异性探针包含在其5’或3’端的第二标签，还包含第二报道子； (b)用所述具有外切核酸酶活性的核酸聚合酶切割第二杂交的靶特异性探针以从所述第二标签释放所述第二报道子； (c)使所述第二标签与固定在第二固体支持物上的互补性第二抗标签杂交；和 (c)通过检测来自所述第二固体支持物上所述第二报道子之信号的降低来检测所述第二靶核酸。42.权利要求41所述的方法，其中所述第一固体支持物和所述第二固体支持物是一个固体支持物上的空间上离散的位置。43.权利要求41所述的方法，其中所述第一固体支持物与所述第二固体支持物是物理上分离的。44.权利要求41所述的方法，其中所述第一报道子与所述第二报道子是相同的。45.权利要求41所述的方法，其中所述第一报道子与所述第二报道子是不同的。46.权利要求34所述的方法，其还包括使所述样品和与所述靶核酸的第二链上的区域互补的第二靶特异性引物相接触。47.权利要求46所述的方法，其还包括进行多个聚合酶链反应循环。48.权利要求47所述的方法，其中所述多个聚合酶链反应循环在没有用于在循环之间除去自由漂浮荧光团的洗涤步骤的情况下进行。49.权利要求47所述的方法，其中检测来自所述固体支持物上所述报道子之信号的降低包括在进行所述多个聚合酶链反应循环之前和之后检测所述信号。50.权利要求47所述的方法，其中检测来自所述固体支持物上所述报道子之信号的降低包括仅在进行所述多个聚合酶链反应循环之后检测所述信号。51.权利要求47所述的方法，其还包括对所述样品中所述靶核酸的量进行定量。52.权利要求51所述的方法，其中对所述样品中所述核酸靶的量进行定量包括使用标准曲线。53.权利要求51所述的方法，其中对所述样品中所述核酸靶的量进行定量包括使用终点定量。54.权利要求51所述的方法，其中对所述样品中所述核酸靶的量进行定量包括通过将所述信号相对于背景可检测时的PCR循环数与存在的靶标的量相关联来确定所述核酸靶的量。55.权利要求51所述的方法，其中对所述样品中所述靶核酸的量进行定量包括确定所述革El核酸的相对量。56.权利要求34所述的方法，其还包括所述抗标签与所述固体支持物之间的接头。57.—种用于在样品中检测祀核酸的方法,其包括: (a)使样品和与靶核酸第一链上第一区互补的第一靶特异性引物以及与所述第一区下游的所述靶核酸第一链上第二区互补的靶特异性探针在适于所述靶核酸与所述第一靶特异性引物以及所述靶特 异性探针杂交的条件下相接触，其中所述靶特异性探针包含与在其5’或3’端的标签序列相连接的荧光团和在所述荧光团和所述标签序列相反端的生物素； (b)用具有外切核酸酶活性的核酸聚合酶切割杂交的靶特异性探针，从而将所述荧光团与所述生物素分离； (c)从所述样品中除去所述生物素；和 (d)通过检测来自所述荧光团的信号来检测所述靶核酸。58.权利要求57所述的方法，其中所述靶特异性引物和所述靶特异性探针与所述靶核酸上的相邻序列杂交。59.权利要求57所述的方法，其中所述靶特异性引物和所述靶特异性探针与所述靶核酸上的非相邻序列杂交。60.权利要求57所述的方法，其还包括用所述具有外切酶活性的核酸聚合酶延伸所述靶特异性引物。61.权利要求57所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：布赖恩·施拉德尔，道格拉斯·F·惠特曼，
申请(专利权)人：露美内克丝公司，
类型：发明
国别省市：美国;US