本发明专利技术提出一种在体外构建羊膜上皮细胞与丝素蛋白支架复合体的方法，其步骤包括：羊膜上皮细胞的分离培养；原代细胞的纯化；原代细胞的鉴定；羊膜细胞接种到丝素蛋白支架上进行空间培养；扫描电镜观察结果。本发明专利技术的体外将羊膜细胞同丝素蛋白支架构建复合体的方法，先采用人类剖宫产后废弃的羊膜作为材料，获取羊膜上皮细胞进行体外培养，并在一定条件下进行细胞纯化，将纯化后的细胞同丝素蛋白支架构建组织工程材料，为细胞营造良好的空间生长环境，这项发明专利技术为不久的将来临床应用羊膜来源的细胞移植治疗中枢神经系统各种创伤性疾病的功能修复提供了新的思路。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种将人类羊膜上皮细胞体外同丝素蛋白支架构建复合体的方法。
技术介绍
中枢神经系统(central nervous system, CNS)损伤后的治疗和功能重建仍是当今生物医学界一大难题，传统观念认为，损伤后神经元以及轴突几乎无自发再生能力，从而阻碍了 CNS的自身修复功能。Aguayo等在20世纪80年代研究发现，CNS轴突是可以再生的，只是中枢神经微环境不利于其再生，因此必须进行有效的外部干预来激发残留的神经元或进行细胞移植替代，诱导受损神经轴突再生，恢复神经冲动在损伤部位的传递，最终达到功能恢复。以往研究者利用羊膜组织对损伤的神经进行物理性“桥接”使其能够继续生长修复，近年来，研究发现AECs许多新特征，其中尤以AECs对神经系统的作用最为引人瞩目其与神经组织良好的整合性，分泌神经营养因子及免疫耐受性使得AECs在治疗CNS疾病中得到了很好的应用。AECs移植修复CNS损伤的策略主要包括补充失去的神经元以及改善损伤部位微环境两个方面。AECs可 填充损伤部位充当细胞桥，引导再生性出芽，同时抑制胶质细胞的过度增生，其自分泌神经营养因子可以改善损伤部位的微环境，进一步刺激残存神经元与轴突的再生。蚕丝由丝素和丝胶两种蛋白组成，用胰酶去除丝胶后可制成为丝素蛋白支架。丝素蛋白是一种具有良好生物相容性和生物降解性的细胞外基质材料，具有理想的三维空间构型，为细胞的停泊、生长、繁衍、新陈代谢、新组织形成提供支持。该支架的降解产物不对细胞繁殖产生不利的影响；其降解速度与细胞的增殖速度相匹配；具有一定的柔韧性，使之既能同机体组织紧密贴合，又不会对机体组织造成机械损伤等。近年来，丝素蛋白这种天然高分子纤维蛋白已广泛应用于组织工程研究。本研究将羊膜细胞同丝素蛋白构建成复合体的体外细胞培养体系，观察细 胞生长增殖过程，为组织工程最终应用于临床提供前期准备。
技术实现思路
本专利技术应用体外细胞培养技术构建羊膜上皮细胞与丝素蛋白支架复合体。具体的方法步骤包括S1:羊膜上皮细胞的分离培养取乙肝表面抗原及HIV抗体检测均阴性的孕妇剖宫产手术后获取的羊膜，大小约15X15cm，分离、去除残存的绒毛膜，PBS反复冲洗，直到洗尽血性液，将羊膜剪碎成直径约l_2mm左右的小碎片，倒入有盖玻璃皿中，分别加入O. 25%胰酶和EDTA各15ml，37°C消化7_8分钟，用PBS液IOOml稀释后经200目滤网过滤，同时在滤液中加入含5%FBS培养液终止消化，IOOOrpm离心6min收集细胞，接种在含10%FBS的RPMI1640的培养皿中，于37°C含5%C02的培养箱内培养。S2 :原代细胞的纯化对原代细胞分离培养至7天后进行纯化，(I)在培养液中加Λ Ara-C,作用浓度为10_6mol/L，作用时间为36h。(2)更换新鲜培养基继续培养Id。(3)再次向培养皿中加入Ara-C，作用浓度为10_7mol/L，作用时间为12h。(4)更换新鲜培养基继续培养Id。(5)弃培养基，D-Hank清洗细胞2次，O. 25%胰酶消化5min，FCS终止消化，800R/min离心5min，弃上清后全培养基继续培养。S3 :原代细胞的鉴定取上述纯化后的细胞继续培养3d后，用胰酶消化，PBS液调整细胞浓度为lX106/ml，分别加入下列鼠抗人单克隆抗体CD29-FITC、CD34-FITC、CD44-PE、CD45-PE、CD73-PE、CD90PE、CD105-FITC、CD106-PE、CD166-FITC、HLA-DR-PE，置4° C孵育30min，PBS洗2遍，直接进行流式细胞仪分析。S4 :羊膜细胞丝素蛋白支架复合体的构建将上述体外培养并经过纯化后的羊膜上皮细胞调整浓度为I X 106/ml，将细胞悬液滴在灭菌处理过的丝素蛋白支架上，放入24孔培养板中悬空孵育4小时，待细胞充分吸附在支架上后再加入10%FBS+RPMI 1640全培养基，令细胞完全浸没，2到3天半量换液，每天进行倒置显微镜下观察细胞贴壁及生长情况。S5 :扫描电镜观察第十天取出支架复合物标本放入2. 5%戊二醛固定，PBS冲洗后，常规脱水，临界点干燥喷金在扫描电镜下观察细胞的生长情况。本专利技术将具有多分化潜能的羊膜上皮细胞同具有着良好生物相容性和生物降解性的丝素蛋白支架构建复合体，这种空间立体化培养的结果是明显促进了细胞的增殖、分泌，该专利技术为组织工程学应用于中枢神经系统损伤的修复作好了准备。附图说明通过下面结合附图的详细描述，本专利技术前述的和其他的目的、特征和优点将变得显而易见。其中图1所示为本专利技术的体外构建人类羊膜上皮细胞与丝素蛋白支架复合体的方法步骤流程图。 具体实施例方式主要实验仪器倒置相差显微镜CK-40型(日本Olympus)、荧光显微镜BX-51型(日本Olympus)、数字成像系统DP-50 (日本01ympus)、C02培养箱(SPXCorporation)、流式细胞仪(美国Beckman-Coulter公司)、离心机TDL-5 (上海安产科学仪器厂)、恒温冷冻切片机CM1900型(德国Leica)、培养皿、培养板(美国Corning公司)、超净工作台(苏州苏净安泰公司)、深低温冰箱 MDF-382E (SANYO Corporation)、紫外分光光度计(北京欧普特)。主要材料试剂RPMI1640(Gibco公司)，胎牛血清(美国Hyclone公司)，胰蛋白酶(美国Sigma公司)，青霉素、链霉素(Gibco/BRL),EDTA(Sigma)，焦油紫(上海凯试科技)，PE或FITC标记的鼠抗人CD29、CD34、CD44、CD45、⑶49d、HLA-DR单克隆抗体(美国BD公司)，N2辅助因子(上海索莱宝公司)，bFGF、EGF (上海欣百诺生物科技公司)，L-Glutamine (美国Invitrogen), mIGF (以色列ProSpec-Tany公司)，甲状腺素(美国Magical Scientifi c，LLC. )，RT-PCR试剂盒和Galc、MBP检测试剂盒(Promega 公司)，Trizol 试剂(美国 Invitrogen),鼠抗人 GFAP IgG 单抗(Santa Cruz), 抗人MAP IgG单抗(Transduction Laboratories),鼠抗人NFIgG单抗(Sigma),鼠抗人GalcIgG单抗(Sigma),鼠抗人MBP IgG单抗(Cymbus), ant1-neuN (北京博奥森生物技术)，丝素蛋白支架(由苏州大学材料工程学院提供)，H0echst33342 (Sigma公司)，HRP(Boster),TMB 显示剂(AMRESC0 分装)，鼠抗人 Vimentin IgG 单抗(Santa Cruz)，鼠抗人 CK19 IgG 单抗(上海信然生物)。所述人类羊膜上皮细胞与丝素蛋白支架复合体构建的方法包括如下步骤S1:羊膜上皮细胞的分离培养取乙肝表面抗原及HIV抗体检测均阴性的孕妇剖宫产手术后获取的羊膜，大小约15X15cm，分离、去除残存的绒毛膜，PBS反复冲洗，直到洗尽血性液，将羊膜剪碎成直径约l_2mm左右的小碎片，倒入有盖玻璃皿中，分别加入O. 25%胰酶本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种在体外构建羊膜上皮细胞与丝素蛋白支架复合体的方法，其包括如下步骤：S1：羊膜上皮细胞的分离培养:取乙肝表面抗原及HIV抗体检测均阴性的孕妇剖宫产手术后获取的羊膜，大小约15×15cm，分离、去除残存的绒毛膜，PBS反复冲洗，直到洗尽血性液，将羊膜剪碎成直径约1?2mm左右的小碎片，倒入有盖玻璃皿中，分别加入0.25%胰酶和EDTA各15ml，37℃消化7?8分钟，用PBS液100ml稀释后经200目滤网过滤，同时在滤液中加入含5%FBS培养液终止消化，1000rpm离心6min收集细胞，接种在含10%FBS的RPMI1640的培养皿中，于37℃含5%CO2的培养箱内培养。S2：原代细胞的纯化:对原代细胞分离培养至7天后进行纯化，（1）在培养液中加入Ara?C,作用浓度为10?6mol/L，作用时间为36h。（2）更换新鲜培养基继续培养1d。（3）再次向培养皿中加入Ara?C,作用浓度为10?7mol/L，作用时间为12h。（4）更换新鲜培养基继续培养1d。（5）弃培养基，D?Hank清洗细胞2次，0.25%胰酶消化5min，FCS终止消化，800R/min离心5min，弃上清后全培养基继续培养。S3：原代细胞的鉴定:取上述纯化后的细胞继续培养3d后，用胰酶消化，PBS液调整细胞浓度为1×106/ml，分别加入下列鼠抗人单克隆抗体：CD29?FITC、CD34?FITC、CD44?PE、CD45?PE、CD73?PE、CD90PE、CD105?FITC、CD106?PE、CD166?FITC、HLA?DR?PE，置4°C孵育30min，PBS洗2遍，直接进行流式细胞仪分析。S4：羊膜细胞丝素蛋白支架复合体的构建:将上述体外培养并经过纯化后的羊膜上皮细胞调整浓度为1×106/ml，将细胞悬液滴在灭菌处理过的丝素蛋白支架上，放入24孔培养板中悬空孵育4小时，待细胞充分吸附在支架上后再加入10%FBS+RPMI1640全培养基，令细胞完全浸没，2到3天半量换液，每天进行倒置显微镜下观察细胞贴壁及生长情况。S5：扫描电镜观察:第十天取出支架复合物标本放入2.5%戊二醛固定，PBS冲洗后，常规脱水，临界点干燥喷金在扫描电镜下观察细胞 的生长情况。...
【技术特征摘要】
1.一种在体外构建羊膜上皮细胞与丝素蛋白支架复合体的方法，其包括如下步骤51:羊膜上皮细胞的分离培养取乙肝表面抗原及HIV抗体检测均阴性的孕妇剖宫产手术后获取的羊膜，大小约15X15cm，分离、去除残存的绒毛膜，PBS反复冲洗，直到洗尽血性液，将羊膜剪碎成直径约1-2_左右的小碎片，倒入有盖玻璃皿中，分别加入0. 25%胰酶和EDTA各15ml，37°C消化7_8分钟，用PBS液100ml稀释后经200目滤网过滤，同时在滤液中加入含5%FBS培养液终止消化，1000rpm离心6min收集细胞，接种在含10%FBS的 RPMI1640的培养皿中，于37°C含5%C02的培养箱内培养。52:原代细胞的纯化对原代细胞分离培养至7天后进行纯化，(I)在培养液中加入 Ara-C,作用浓度为10_6mol/L，作用时间为36h。(2)更换新鲜培养基继续培养Id。(3)再次向培养皿中加入Ara-C，作用浓度为10_7mol/L，作用时间为12h。(4)更换新鲜培养基继续培养Id。(5)弃培养基，D-Hank清洗细胞2次，0. 25%胰酶消化5min，FCS终止消化，800R/ min离心5min,弃上清后全培养基继续培养。53:原代细胞的鉴定取上述纯化后的细胞继续培养3d后，用胰酶消化，PBS液调整细胞浓度为IX 106/ml，分别加入下列鼠抗人单克隆抗体CD29-FITC、CD34-FITC、CD44-PE、 CD45-PE、CD73-PE、CD90PE、CD105...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐杰，房文峰，朱爱华，
申请(专利权)人：吴卫江，
类型：发明
国别省市：
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