人类羊膜上皮细胞与丝素蛋白支架复合体的构建方法技术

本发明专利技术提出一种在体外构建羊膜上皮细胞与丝素蛋白支架复合体的方法，其步骤包括：羊膜上皮细胞的分离培养；原代细胞的纯化；原代细胞的鉴定；羊膜细胞接种到丝素蛋白支架上进行空间培养；扫描电镜观察结果。本发明专利技术的体外将羊膜细胞同丝素蛋白支架构建复合体的方法，先采用人类剖宫产后废弃的羊膜作为材料，获取羊膜上皮细胞进行体外培养，并在一定条件下进行细胞纯化，将纯化后的细胞同丝素蛋白支架构建组织工程材料，为细胞营造良好的空间生长环境，这项发明专利技术为不久的将来临床应用羊膜来源的细胞移植治疗中枢神经系统各种创伤性疾病的功能修复提供了新的思路。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别涉及一种将人类羊膜上皮细胞体外同丝素蛋白支架构建复合体的方法。
技术介绍
中枢神经系统(central nervous system, CNS)损伤后的治疗和功能重建仍是当今生物医学界一大难题，传统观念认为，损伤后神经元以及轴突几乎无自发再生能力，从而阻碍了 CNS的自身修复功能。Aguayo等在20世纪80年代研究发现，CNS轴突是可以再生的，只是中枢神经微环境不利于其再生，因此必须进行有效的外部干预来激发残留的神经元或进行细胞移植替代，诱导受损神经轴突再生，恢复神经冲动在损伤部位的传递，最终达到功能恢复。以往研究者利用羊膜组织对损伤的神经进行物理性“桥接”使其能够继续生长修复，近年来，研究发现AECs许多新特征，其中尤以AECs对神经系统的作用最为引人瞩目其与神经组织良好的整合性，分泌神经营养因子及免疫耐受性使得AECs在治疗CNS疾病中得到了很好的应用。AECs移植修复CNS损伤的策略主要包括补充失去的神经元以及改善损伤部位微环境两个方面。AECs可 填充损伤部位充当细胞桥，引导再生性出芽，同时抑制胶质细胞的过度增生，其自分泌神经营养因子可以改本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在体外构建羊膜上皮细胞与丝素蛋白支架复合体的方法，其包括如下步骤：S1：羊膜上皮细胞的分离培养:取乙肝表面抗原及HIV抗体检测均阴性的孕妇剖宫产手术后获取的羊膜，大小约15×15cm，分离、去除残存的绒毛膜，PBS反复冲洗，直到洗尽血性液，将羊膜剪碎成直径约1?2mm左右的小碎片，倒入有盖玻璃皿中，分别加入0.25%胰酶和EDTA各15ml，37℃消化7?8分钟，用PBS液100ml稀释后经200目滤网过滤，同时在滤液中加入含5%FBS培养液终止消化，1000rpm离心6min收集细胞，接种在含10%FBS的RPMI1640的培养皿中，于37℃含5%CO2的培养箱内培养。S2：原代细胞的纯...

【技术特征摘要】
1.一种在体外构建羊膜上皮细胞与丝素蛋白支架复合体的方法，其包括如下步骤51:羊膜上皮细胞的分离培养取乙肝表面抗原及HIV抗体检测均阴性的孕妇剖宫产手术后获取的羊膜，大小约15X15cm，分离、去除残存的绒毛膜，PBS反复冲洗，直到洗尽血性液，将羊膜剪碎成直径约1-2_左右的小碎片，倒入有盖玻璃皿中，分别加入0. 25%胰酶和EDTA各15ml，37°C消化7_8分钟，用PBS液100ml稀释后经200目滤网过滤，同时在滤液中加入含5%FBS培养液终止消化，1000rpm离心6min收集细胞，接种在含10%FBS的 RPMI1640的培养皿中，于37°C含5%C02的培养箱内培养。52:原代细胞的纯化对原代细胞分离培养至7天后进行纯化，(I)在培养液中加入 Ara-C,作用浓度为10_6mol/L，作用时间为36h。(2)更换新鲜培养基继续培养Id。(3)再次向培养皿中加入Ara-C，作用浓度为10_7mol/L，作用时间为12h。(4)更换新鲜培养基继续培养Id。(5)弃培养基，D-Hank清洗细胞2次，0. 25%胰酶消化5min，FCS终止消化，800R/ min离心5min,弃上清后全培养基继续培养。53:原代细胞的鉴定取上述纯化后的细胞继续培养3d后，用胰酶消化，PBS液调整细胞浓度为IX 106/ml，分别加入下列鼠抗人单克隆抗体CD29-FITC、CD34-FITC、CD44-PE、 CD45-PE、CD73-PE、CD90PE、CD105...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐杰，房文峰，朱爱华，
申请(专利权)人：吴卫江，
类型：发明
国别省市：