本发明专利技术涉及生物技术领域，具体为一种用于包装病毒的人胚肾细胞293T-C10单克隆细胞株及筛选方法。通过去除293T细胞支原体，在对数生长期经单克隆筛选，得到均一性的单克隆细胞，比较不同转染与出毒效率，筛选得到单克隆细胞株。这种细胞株保藏号为CCTCC?C201281，具有很高的转染效率和病毒包装的稳定性，相比较筛选前的293T细胞出毒效率上升明显，不进行超速离心即可感染绝大多数肿瘤及其他待感染的细胞，满足大部分实验需求。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体为一种用于包装病毒的293T细胞单克隆细胞株及筛选方法，并且该细胞株具有很高的转染效率和病毒包装的稳定性。
技术介绍
293细胞是转染腺病毒ElA基因的人肾上皮细胞系，293T细胞由293细胞派生，可表达SV40大T抗原，主要用于包装病毒或瞬时转染以过量表达各种目标蛋白。慢病毒的类型有人免疫缺陷型病毒HIV、猴免疫缺陷型病毒SIV、猫免疫缺陷型病毒FIV、马传染性贫血EIA等，培养时间较长。按照传统的病毒包装方法，含有病毒颗粒的293T细胞的上清液需要经过超速离心加以浓缩(方法为超速离心后，弃上清液，将病毒溶解于很小的体积内，已获得高浓度的病毒溶液。这样在实验时，只需加入很小的体积，即可获得很高的感染效率，并且可以避免病毒溶液所产生的细胞毒性)，然后用于后续的细胞功能学实验研究。由于超速离心费时费力，且成本较高，因此如果病毒粗液的滴度可以达到5xl06 lxlO7，则无需超速离心即可用于后续的细胞功能学检测。前期实验已经发现，目前使用的293T细胞出毒效率并不高，病毒粗液滴度无法达到5xl06-lxl07。因此，筛选高出毒效率的293T细胞成为我们需要克服和解决的重要问题。我们分析293T细胞不能高效出毒的原因有1) 293T细胞在实验室长期培养传代中存在细菌、支原体污染的潜在威胁，从而使细胞不能以最佳状态进行病毒包装。2)由于293T细胞的异质性，细胞内同时存在出毒效率高和出毒效率低的克隆，所以从原始293T细胞中通过单克隆筛选的方式，可能筛选到具有高出毒效率的293T细胞克隆。支原体污染细胞培养(特别是传代细胞)被支原体污染是个世界性问题。国内外研究表明，95%以上是以下四种支原体口腔支原体(M. orale)、精氨酸支原体(M. arginini)、猪鼻支原体(M. hyorhinis)和莱氏无胆甾原体(A. Iaidlawii),为牛源性。据报道，支原体感染会对细胞造成多方面的影响，如引起细胞变形，影响DNA合成，抑制细胞生长等。这些包括代谢、免疫或生化特性、生长状况、以及细胞存活等多方面的改变使细胞学的功能研究蒙上一层阴影。单克隆筛选的方法用于纯化单一的功能性细胞，常用于原代细胞的分离培养，制备单克隆抗体的杂交瘤筛选等。此方法简单易操作，获得的克隆细胞均一性好，单克隆率较高。所以用于高转染效率高滴度的293T单克隆细胞株筛选较适合。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种人胚肾细胞293T细胞单克隆株，出毒效率、转染率和感染率高，病毒包装的稳定性好。本专利技术还提供了上述293T细胞单克隆株的制备方法。本专利技术另一个目的是将这种293T细胞单克隆株用于包装慢病毒。本专利技术提供的人胚肾细胞293T-C10单克隆细胞株，保藏号为CCTCC N0:C201281,以下称为293T-C10或ClO克隆(中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉，武汉大学；邮编430072 ;培养物名称人胚肾细胞293T-C10 ;2012年7月11日保藏，保藏编号CCTCCN0:C201281)o该293T-C10细胞属于人胚肾细胞，培养方法为90%高糖DMEM+10%FBS培养基，5%C02，37°C 培养。保存条件液氮-196 °C冻存。上述人胚肾细胞293T-C10单克隆细胞株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤(I)对数生长期的人胚肾细胞293T细胞进行去除支原体的操作；去除支原体后的细胞表面光滑，细胞饱满，折光性好，细胞生长状态良好；(2)去除支原体后的293T细胞稀释后贴壁培养形成单克隆，并扩大培养；具体方法为，用梯度稀释法将细胞稀释至每孔一个细胞，细胞贴壁后培养数周形成单克隆。筛选增值明显，细胞均一性好的单克隆进行扩大培养；(3)将单克隆细胞株进行磷酸钙-DNA转染，选择转染效率高的单克隆细胞株培养36 60小时(优选为48小时)，选择出毒效率高的单克隆细胞株；并将包装的病毒感染肿瘤细胞，确定和筛选感染力强、对细胞毒性低的细胞株；通过比较不同单克隆的磷酸钙-DNA转染效率与出毒效率，同时感染肿瘤细胞进行感染效率验证和对细胞毒性的观察比较。进一步，通过不同基因构建的质粒反复进行病毒包装测试比较，验证筛选出的单克隆细胞病毒包装的稳定性。检测筛选出的单克隆细胞的病毒包装稳定性。所得到的293T-C10单克隆细胞株可用于包装病毒，优选的，这种293T-C10单克隆细胞株(CCTCC N0:C201281)可应用于慢病毒，这种慢病毒可以是基于pCDH-CMV-MCS-EFl-copGFP (SBI :CD511B_1)质粒或 pFUGW-Hl 质粒包装的慢病毒。本专利技术通过去除293T细胞支原体，在对数生长期经单克隆筛选，得到均一性的单克隆细胞，比较不同转染与出毒效率，并用于肿瘤细胞感染验证以及重复包装实验验证细胞包装能力的稳定性。本专利技术的优点在于，去除支原体后的细胞在培养至对数生长期时筛选出的单克隆细胞株具有出毒滴度稳定，能较好的感染肿瘤细胞，且对细胞毒性较小等诸多优点。符合专利技术目的，满足实验室功能实验的需求。相比于现有技术，本专利技术的有益效果在于筛选出的293T单克隆细胞株ClO转染效率高达95%以上，病毒粗液的滴度可以达到5xl06 lxl07Tu/ml，重复病毒包装出毒效率稳定可靠。相比较筛选前的293T细胞出毒效率上升明显，不进行超速离心即可感染绝大多数肿瘤及其他待感染的细胞，满足大部分实验需求。附图说明图I为实施例I去除支原体前A和去除支原体后B 293T细胞的状态可见光。图2为实施例2中，去除支原体后的293T细胞株单克隆C2 (A)与ClO (B)可见光。图3为实施例3中，293T细胞株单克隆Cl C14用磷酸钙-DNA转染后的细胞形态(可见光和荧光)。图4为实施例3中，非单克隆293T细胞用293T细胞株单克隆Cl C14包装的病毒感染后的细胞形态(可见光和荧光)。图5为实施例3中，人骨肉瘤细胞系Saos-2细胞用293T细胞株单克隆C2、C6、CIO、C13和C14包装的病毒感染的细胞形态(可见光和荧光)。图6为实施例3中，293T细胞株单克隆C2和ClO用pCDH-CMV-MCS-EFl-copGFP载体质粒进行磷酸钙-DNA转染24小时后的细胞形态(可见光和荧光)。图7为实施例3中，293T细胞株单克隆C2和ClO用pCDH-CMV-MCS-EFl-copGFP载体质粒进行磷酸钙-DNA转染72小时的上清液离心过滤除去细胞碎片后滴度检测和拍照(可见光和荧光)。图8为实施例3中，用C2和ClO克隆包装的病毒在人前列腺癌细胞系中进行感染实验，每孔分别加入100 μ L和10 μ L粗提液，三天后的照片(可见光和荧光)。图9为实施例4中，293Τ细胞株单克隆ClO用不同的质粒转染后，滴度检测拍照(可见光和荧光)。图(A)分别为三种克隆用质粒的磷酸钙-DNA转染24小时后可见光和荧光照片，图(B)为pscN即滴度参照病毒，为纽恩(上海)生物科技有限公司产品；图(C)为用质粒的磷酸钙-DNA转染48小时后收集的病毒上清，感染293T细胞(用12孔板进行细胞培养)3天后的荧光图片，每个克隆滴度检测时分别加入100 μ L和10 μ L体积的病毒。HY-15 pCDH-GFP 是 pC本文档来自技高网...
【技术保护点】
人胚肾细胞293T？C10单克隆细胞株，其特征在于，保藏号为CCTCCC201281。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王海峰，姚远颋，谈竹君，劳昕元，
申请(专利权)人：上海黄离生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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