一种siRNA表达载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于构建siRNA表达载体的空载体及其重组载体和应用。该空载体从5’到3’依次包括：1）来源于CMV?RNA聚合酶II依赖型启动子序列；2）pri-MiR21前部片段序列SEQ?ID?NO.1；3）限制性内切酶酶切位点序列；4）pri-MiR21后部片段序列SEQ?ID?NO.2；5）终止子序列。在限制性内切酶酶切位点插入序列siRNA正义序列-MiR21环结构序列-siRNA反义序列，即得siRNA重组表达载体。本发明专利技术采用RNA?Pol?II启动子，可方便有效地将shRNA连接到pri-MiR21骨架上，使shRNA经由RNAPol?II启动子稳定表达，且表达高效，提高了RNAi的敲减效率。

SiRNA expression vector and application thereof

The invention discloses an empty carrier for constructing siRNA expression vector, a recombinant carrier and application thereof. The empty vector from 5 'to 3' includes: 1) from CMV? RNA polymerase II dependent promoter sequence; 2) pri-MiR21 front sequence SEQ? ID? NO.1 3); restriction endonuclease sites; 4) pri-MiR21 rear sequence SEQ? ID? NO.2 5) termination; sequence. In the restriction endonuclease site insert sequence siRNA sequence -MiR21 sequence structure of the -siRNA antisense sequence, namely siRNA recombinant expression vector. The invention adopts the RNA Pol II promoter, which can conveniently and effectively connect the shRNA to the pri-MiR21 skeleton, so that the shRNA can be stably expressed through the RNAPol II promoter, and the expression is high, and the knockdown efficiency of RNAi is improved.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及一种siRNA表达载体及其应用，特别的涉及一种用于构建siRNA表达载体的空载体及其重组载体和应用。
技术介绍
由dsRNA 剪切形成的 siRNA。siRNA 长 21_25nt，3’ 端突出。siRNA 的 3' 末端 2_nt的突出对靶点识别的特异性起一定的作用，可将其限定在第一个碱基对相邻的不成对碱基的位置。随后 siRNA 与 RNA 诱导沉默复合物(RNA_induced silencing complex, RISC)结合，解旋成单链，活化的RISC受已成单链的siRNA引导，序列特异性地结合在靶mRNA上并将其切断，引发靶mRNA的特异性分解，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默。近年来以数以千计的人类和老鼠基因为目标创建了 RNAi库，在哺乳动物中利用小的干涉RNA和短发夹RNA (short hairpin RNAs, shRNA)来进行RNA干涉以使基因沉默已经成为强大而有力的生物工具，通过siRNA，利用具有同源性的双链RNA (dsRNA)诱导序列特异的目标基因的沉默，可以迅速阻断基因活性。经化学合成的siRNA被转染到细胞内，能发挥沉默基因的作用，但因其量少，只能在细胞内发挥短暂的效应，且由于其合成成本高，在一定程度上限制了其应用。现有的对于动物细胞的siRNA研究中，通过使用带有RNA Pol III启动子的质粒，对病毒进行钙转或包装成为慢病毒，对细胞进行转染，以达到RNAi的功能。但这种方法仍然有较大的缺陷，首先RNA Pol III启动子驱动能力较弱，仅能驱动约IOObp大小的片段，同时对启动子下游的基因的表达效率不高。其次，对引入的shRNA的检测需共表达一个由RNA Pol III启动子驱动的报告基因，而该标记基因的表达并不总是与shRNA的表达相一致。另外，调控RNA PolIII启动子的表达比较困难。2004 年 Daniel 等(Daniel Boden, et al.，2004，Vol.32，N0.3:1154 1158)，使用pAAV-U6-MCS质粒进构建，克隆得到has-mir-30的前体71nt的片段，将MiR-30替换成tat-shRNA，使用RNA Pol III启动子，启动并成功表达了 MiR-30骨架的tat基因siRNA。这一实验证明，shRNA导入至MicroRNA的骨架后，可以模拟MicroRNA，形成小片段的siRNA。但这种方法仍然未能摆脱使用RNA Pol III启动子，虽然可以证明micro RNA骨架可以用于shRNA的表达，但并没有解决质粒表达shRNA效率较低的问题。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，现有的siRNA过表达技术，主要使用的是RNA模拟物以及RNA Pol III启动子所启动的shRNA质粒，前者不能对靶基因稳定敲减，后者则是存在表达量较弱的缺点。本专利技术为解决上述技术问题的第一个技术方案是:一种用于构建siRNA表达载体的空载体，其序列从5’到3’依次包括以下序列:I)来源于CMV RNA聚合酶II依赖型启动子序列；2) pr1-MiR21前部片段序列；3)限制性内切酶酶切位点序列；4)pr1-MiR21后部片段序列；和5)终止子序列。其中，所述的RNA聚合酶II依赖型启动子是来源于CMV (即疱疹病毒亚P科)的启动子。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，初级转录物称为pr1-miRNA。pri_miRNA长度从几百到几千个碱基不等,带有5 ‘帽子和3’polyA尾巴，以及I到数个发夹径环结构。pr1-miRNA经剪切可产生约70个碱基的miRNA前体，即pre-miRNA。由于不存在内含子，所以pr1-miRNA可以从基因组DNA中直接扩增得到。本专利技术中，所述的pr1-MiR21前部片段序列是指pri_MiR21cDNA从MiRNA21前体序列的5’前约200-300nt到3’开始的茎环结构中的第一个茎干的序列，不包括MiRNA及环。更佳的，所述的pr1-MiR21前部片段序列是指从MiR21前体的前臂(即茎环结构中的第一个茎干的序列)及MiR21前体5’端前200nt-300nt的部分。所述的pri_MiR21前部片段序列可由人肝脏基因组DNA 扩增获得。较佳的，所述pri_MiR21前部片段序列如SEQID N0.1 所示。所述的pr1-MiR21后部片段序列是指pr1-MiR21cDNA从5’端开始的茎环结构中的第二个茎干的序列到MiRNA前体的3’端后约200-300nt，不包括MiRNA* (与MiRNA互补的MiRNA)及环。更佳的，所述的pr1-MiR21前部片段序列是指从MiR21前体的后臂(即茎环结构中的第二个茎干的序列)及MiR21前体3’端后200nt-300nt的部分。所述的pri_MiR21后部片段序列可由人肝脏基因组DNA扩增获得。较佳的，所述pri_MiR21后部片段序列如SEQ ID N0.2 所示。本专利技术中所述的pri_MiR21前部片段或后部片段大小各控制在200_300bp，也能够实现专利技术目的。所述的限制性内切酶酶切位点可以是常规的任何限制性内切酶可以识别并切割的位点，较佳的可以是Bsm A1.Bsm B1.Bsp CNI (非对称切割的内切酶)酶切位点，最佳的是Bsm BI酶切位点。优选的，该酶切位点由5，-3，反向顺序为，BsmBI反向序列，SalI ,BsmBI正向序列。该酶切位点序列优选的如SEQ ID N0.3所示。所述的终止子序列是来源于SV40PolyA(猴空泡病毒PolyA，简称PolyA)序列，序列是有转录终止作用和使转录的mRNA添加PolyA尾的DNA序列(240bp)，含有AATAAA六核苷酸多腺苷化信号(Polyadenylation signal)。更优选的,所述终止子的序列如SEQ IDN0.4所示。本专利技术所述空载体的骨架是常规的siRNA表达载体，可以是pCMV、pTR_UF5、pEGFP、pEXPR-1BA3等等。较佳的为pCDH系列质粒。本专利技术为解决上述技术问题的第二个技术方案是:一种表达siRNA的重组载体，其序列从5’到3’依次包括以下序列:I)来源于CMV RNA聚合酶II依赖型启动子序列；2) pr1-MiR21前部片段序列；3) siRNA正义序列_MiR21环结构序列-siRNA反义序列；4) pr1-MiR21后部片段序列；和5)终止子序列。其中1)、2)、4)、5)如上文所述。3)中表示的是插入上述空载体酶切位点的外源的表达siRNA的基因的序列。所述的siRNA的正义序列和反义序列是任何可以沉默目标基因的siRNA的正义序列以及相应的反义序列。可以是已知的各种基因的siRNA的序列，例如可以是Sigma公司的siRNA库中记载的各种基因的siRNA序列。siRNA也可自行设计，取所要敲减的基因的mRNA序列的某段(21-23nt)作为siRNA的正义序列，只要能够沉默该目标基因即可。其中，所述siRNA正义序列是与将被沉默的基因转录的mRNA的21_23个核苷酸cDNA序列。所述siRNA反义序列是与所述siRNA正义序列互补本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于构建siRNA表达载体的空载体，其特征在于，其序列从5’到3’依次包括以下序列：1）来源于CMV?RNA聚合酶II依赖型启动子序列；2）pri?MiR21前部片段序列，其序列如序列表中SEQ?ID?NO.1所示；3）限制性内切酶酶切位点序列；4）pri?MiR21后部片段序列，其序列如序列表中SEQ?ID?NO.2所示；和5）终止子序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：姚远颋，王海峰，费倩岚，谈竹君，劳昕元，
申请(专利权)人：上海黄离生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：