一种牛泡沫病毒感染性克隆的构建及其应用制造技术

本发明专利技术一种牛泡沫病毒感染性克隆的构建及其应用，将在中国分离到的牛泡沫病毒3026(BFV3026)的原病毒基因组cDNA构建成感染性克隆pBFV。分类命名：大肠埃希氏菌Escherichia?coli，保藏日期：2011年6月29日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC?No.4994。用该感染性克隆可模拟牛泡沫病毒3026感染生活周期的特点，经过转染可产生有活性的牛泡沫病毒，为进一步研究其与宿主细胞间的相互作用奠定基础。另外，可在构建牛泡沫病毒基因载体的过程中发挥作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术的技术方案涉及牛泡沫病毒感染性克隆的构建及其应用。
技术介绍
泡沫病毒(Foamy virus, FVs)是一种特殊的反转录病毒,始发现于1954年，由于它不表现任何病害，甚至难以将它同任何疾病联系起来，所以对于它的研究远远滞后于其它反转录病毒，直到近几年，随着基因治疗的发展，FVs的非致病性以及独特的基因表达调控机制赋予其无与伦比的优势用于转移载体的构建，使其研究得以迅速发展。泡沫病毒(Foamy virus, FV)因在体外组织培养过程中可诱使敏感细胞发生内质网肿胀及空泡形成，出现类似泡沫样病变，因而得名。然而，相对泡沫病毒在细胞水平上可引起严重病变，甚至导致细胞崩解，人们迄今尚未发现其引起任何疾病。目前，人类对泡沫病毒的认识还远不足以勾勒出一张完整的图谱，但其人畜共感染的特性，让我们意识到绝不能忽视它的存在。近二十年的研究结果表明，这是一类非常特殊而又古老病毒。此外，随着研究的深入也让我们看到了其诱人的应用前景。·上个世纪初期人们就发现了反转录病毒，但并没引起人类的足够注意。直至上个世纪八十年代，随着高致病性的人T细胞白血病病毒(human T-cell leukaemia virus,HTLV)和人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)的出现，反转录病毒才引起人们足够的重视，对这类病毒的研究也得以逐渐深入。所有反转录病毒所共有的重要特征是:有着相似的基因组结构，病毒在复制周期中以基因组RNA为模板，利用反转录酶合成一条DNA拷贝，再以该拷贝为模板合成线状双链DNA，整合入宿主基因组，才能开始病毒基因的表达，完成病毒基因组的复制，释放出成熟的病毒颗粒。泡沫病毒是一种复杂反转录病毒。基因组为二聚线型单链RNA，长约ll_12kb。在反转录病毒家族中居于首位。其基因组结构与典型的反转录病毒基本相同，其复制过程也需要进行反转录，随后反转录出来的基因组DNA也必须整合至宿主基因组中，才能完成其生活周期。但由于泡沫病毒拥有着不同于其他反转录病毒的基因组成分、生活周期以及基因表达调控方式等，因此2002年国际病毒分类学委员会(ICTV)修改了反转录病毒科的命名规则。将原先该科中的七个属中的六个归到正反转录病毒亚科(Orthoretrovirinae)中，将泡沫病毒单独归为泡沫病毒亚科(Spumaretrovirinae)FVs广泛分布于多种脊椎动物中，已经在人、牛、猫、马、海狮以及所有其它非人灵长类动物如大猩猩、黑猩猩、狒狒、非洲绿猴中发现FVs的存在。实验室驯化的灵长类FVs可以感染从人到鱼几乎所有的脊椎动物细胞利用体外表达的FVs Env重组蛋白可与多种细胞特异结合，FVs抗血清虽可中和这种结合，但不能抑制FVs的感染，表明FVs可能利用多种低亲合力的受体完成侵入过程。泡沫病毒的体外复制无明显的物种或组织特异性，可在多种细胞中完成其生活周期，并导致感染细胞发生强烈病变，形成合胞体，产生大量病毒，最后迅速死亡。但在体内却不引发任何病症,仅建立持续性感染并伴随宿主终身。其中外周血淋巴细胞可能是它主要的复制场所之一，除B细胞、T细胞、单核及巨噬细胞外，不同来源的上皮细胞和成纤维细胞中也可检测到FV的存在。对于人泡沫病毒(Human Foamy Virus, HFV)的大规模分子流行病学调查显示:HFV虽可感染人体，但不会在人群中传播，人类不是FV的天然宿主。虽然第一株FV是1971年分离自一位非洲鼻咽癌患者细胞培养物，但基因多态性分析显示该病毒为猴泡沫病毒(Simian Foamy Virus，SFV)，推测由黑猩猩传染给人，应命名为SFV_hu，表示其为分离自人源细胞的猴泡沫病毒。泡沫病毒在天然宿主中的传播途径为咬或舔，人感染FVs可能由于实验室污染或动物咬伤所致。泡沫病毒的非致病原因尚不明确，推测可能与其在体内的复制水平低有关。对自然感染FV的猴子研究发现，泡沫病毒除能在口腔粘膜和唾液腺中的某些细胞中维持较高转录水平外，在其他细胞包括血液细胞中的转录水平均不高，并有大量复制缺陷型病毒颗粒产生。同时，病毒产生的Bet蛋白亦可能抵御病毒对宿主细胞的感染和裂解，对HFV的研究表明，其合成的Bet蛋白可分泌至胞外并被邻近细胞所摄取且由此获得对HFV的抗性。另夕卜，宿主的免疫反应也可能在抑制病毒复制方面发挥重要作用。被泡沫病毒感染的动物能产生高效价的抗体，包括Gag和Bet抗体以及中和抗体，并在抗体阳性个体的某些组织(包括口腔粘膜)中观察到泡沫病毒基因的沉寂。目前对FV诱发的细胞和体液免疫应答尚缺乏足够了解，也许这恰是解答FVs非致病性的关键所在。虽然有关泡沫病毒的研究尚存在许多未知领域，但对其复制特性、基因表达调控及病毒与宿主细胞相互关系的初步研究显示，利用泡沫病毒构建的基因转移载体有其独特的优势:首先，它可实现对不同种类、不同类型细胞系的转移。以HFV为骨架构建的载体能以整合方式将新霉素磷酸转移酶和碱性磷酸酶等基因导入脊椎动物细胞，如人包皮成纤维细胞、293T细胞、C0S-7细胞、非洲绿猴肾细胞、MDBK细胞、Cf2Th (狗胸腺)细胞、绵羊脉络膜丛细胞及鼠、仓鼠和鸡来源的多种细胞。与其它反转录病毒载体相比，泡沫病毒载体对休眠细胞及体内细胞具有更高的转导效率。其次，对于人类非常安全。泡沫病毒在体内不表现任何病症，迄今在自然感染及实验感染的动物中未发现任何疾病与之对应。尤其对于人类，泡沫病毒不会在其间造成任何传播，使泡沫病毒载体具有极高的安全性。同时，泡沫病毒的各种蛋白皆由独立的mRNA编码，并可通过异源启动子启动表达，而无需病毒其它顺式元件调控，因而可将它们分别克隆于不同表达载体，以反式形式提供包装，可降低载体与辅助质粒间的同源重组。也可用组成型启动子替换转移载体5’LTR中U3区，通过转染仅表达病毒结构蛋白的包装细胞系收集重组病毒，可完全排除复制型病毒颗粒的产生。此外，可以转移大片段的DNA。泡沫病毒的基因组长度在反转录病毒家族中居于首位，由其构建的转移载体具有较其它反转录病毒载体更大的外容量。也可使目的基因获得稳定表达，泡沫病毒载体可使目的基因有效整合于宿主染色体上，并获得迅速表达，不会出现外源基因的沉寂与丢失。同时，易获得高滴度重组病毒。泡沫病毒成熟后，多滞留于细胞内，可通过反复冻融获得高滴度的病毒储液，即使进一步浓缩，也不会丧失感染性。并且不会被人血清灭活，因为多数人体内不存在FV抗体。构建感染性克隆，只是开始，还需要进一步的研究泡沫病毒自身的一些性质，与宿主间的相互作用等内容，充分开发泡沫病毒的应用价值。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是:构建带有BFV cDNA全长的感染性克隆。将本实验分离的牛泡沫病毒BFV3026毒株的cDNA全长构建到可复制的质粒中，构建具有感染性的克隆，可经转染产生野生型的病毒颗粒，也可在质粒水平经分子克隆手段将病毒cDNA进行改造，构建缺失或重组病毒，在研究泡沫病毒分子调节机制、与宿主的相互作用等方面具有很大的应用，同时也为构建病毒载体奠定基础。本专利技术解决该技术问题所采用的技术方案是:一种牛泡沫病毒毒株，分类命名:大肠埃希氏菌Escherichia coli,保藏日期:2011年6月29日，保藏单位:中国微本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牛泡沫病毒感染性克隆，其特征在于：将在中国分离到的牛泡沫病毒3026(BFV3026)的原病毒基因组cDNA构建成感染性克隆pBFV。分类命名：大肠埃希氏菌Escherichia?coli，保藏日期：2011年6月29日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC?No.4994。

【技术特征摘要】
1.一种牛泡沫病毒感染性克隆，其特征在于:将在中国分离到的牛泡沫病毒3026 (BFV3026)的原病毒基因组cDNA构建成感染性克隆pBFV。分类命名:大肠埃希氏菌Escherichia coli,保藏日期:2011年6月29日，保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏编号=CGMCC N0.4994。2.权利要求1所述一种牛泡沫病毒感染性克隆的构建及其应用，其特征在于:将该感染性克隆PBFV模拟牛泡沫病毒3026感染生活周期的特点。3.根据权利要求2所述的权利要求1所述一种牛泡沫病毒感染性...

【专利技术属性】
技术研发人员：谈娟，乔文涛，耿运琪，邴铁军，
申请(专利权)人：天津市国际生物医药联合研究院，南开大学生命科学学院，
类型：发明
国别省市：