本发明专利技术公开了Ａｓｉａｌ型江苏谱系口蹄疫病毒感染性ｃＤＮＡ及其构建方法和应用。所述感染性ｃＤＮＡ包含了保证合成转录本具有感染性所要求的ｐｏＩｙ（Ａ）序列和ｐｏＩｙ（Ｃ）序列，所述ｐｏＩｙ（Ａ）尾具有１９－２２个Ａ；所述ｐｏＩｙ（Ｃ）结构具有１４－２０个聚合Ｃ；其５′末端具有Ｔ７ＲＮＡ聚合酶启动子序列，３′末端具有单一的限制性酶切位点。所述感染性ｃＤＮＡ可以和表达Ｔ７ＲＮＡ聚合酶的真核表达载体组成反向遗传操作系统。该感染性ｃＤＮＡ及其反向遗传操作系统可用于拯救口蹄疫病毒，为研究口蹄疫病毒基因的结构与功能、病毒的分子致病机理、开发口蹄疫病毒减毒疫苗株和新型口蹄疫疫苗等奠定了实验基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及单股正链RNA病毒的感染性克隆，尤其涉及Asial型ロ蹄疫病毒感染性cDNA及其构建方法，本专利技术还涉及由该Asial型ロ蹄疫病毒感染性cDNA和表达T7RNA聚合酶的真核表达载体所组成的江苏谱系Asial型ロ蹄疫病毒的反向遗传操作系统；本发 明还进一歩涉及该感染性cDNA通过体外转录以及该反向遗传操作系统通过体内转录的方式在拯救ロ蹄疫病毒中的应用，属于基因工程领域。
技术介绍
ロ蹄疫病韋(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)属于小 RNA病韋科ロ蹄疫病毒属的成员，为单股正链RNA，其基因组RNA全长约8. 5kb。ロ蹄疫是严重危害偶蹄动物的重要传染病之一，该病引起幼畜死亡、产奶量下降、肉食減少、肉品下降、动物的生产性能降低，导致巨大的经济损失。此外，由于贸易的限制和禁止而引起的损失更大，全世界毎年由此造成的直接经济损失可达数百亿美元。2005年以来在我国江苏、山东、甘肃、北京、河北等地爆发了 Asial型FMD(Asial/JS/CHA/05，GenBank登录号EF149009)，由于在我国江苏省首先分离，被称作Asial型江苏谱系。该谱系ロ蹄疫病毒在我国牛群中ー经流行，传播趋势迅猛，造成的损失极为严重。因此，积极开展Asial型FMD江苏谱系毒株的研究，对我国FMD的防控具有重要的意义。反向遗传操作系统是在分子水平研究病毒的重要工具之一。通过对病毒基因组进行定点突变、缺失、替换基因组的任意部分以产生突变体，借此在分子水平上研究病毒基因的结构与功能、了解决定病毒毒力的分子基础、宿主嗜性与跨种传播的机制。感染性克隆还可用于抗原表位的研究，特别是构象表位的研究。为研究病毒减毒奠定了实验基础，为研制新型疫苗提供了有力的工具。目前已经有报道成功构建了牛源毒株OlK株(Zibert A, Maass G, Strebel K, etal.Infectious loot-and—mouth disease viruses derived from acloned full-lengthcDNA, J Virol，1990,64 :2467-2473)、牛源毒株 A12 株(Rieder E, Bunch T, Brown F,et al. Genetically engineeredfoot-and-mouth disease viruses with poly (C) tractsof two nucleotide arevirulent in mice. J Virol, 1993,67 :5139-5145)、猪源毒株0H/99 株(Guanqing liu, et al. Generation of an infectious cDNA clone of anFMDVstrain isolated from swine. Virus Research, 2004,104 :157-164)以及兔化弱毒疫苗株ZB/CHA/58 (att)(中国专利公开号CN101225395A，专利技术名称亚洲ー型ロ蹄疫病毒感染性cDNA及其构建方法。)ロ蹄疫病毒的感染性cDNA，并在此基础上对FMDV进行了探索性的研究。但上述感染性克隆与我国近年来流行的江苏谱系Asial型ロ蹄疫病毒有着很大的遗传偏离，因此构建符合我国流行情况的江苏谱系Asial型ロ蹄疫病毒的反向遗传操作平台，对开展Asial型ロ蹄疫病毒结构与功能研究以及新型疫苗的研制具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的首要目的是提供ー种Asial型江苏谱系ロ蹄疫病毒的全长感染性cDNA，该全长感染性cDNA包含了保证所合成的转录本具有感染性所要求的poIy(A)序列和poly (C)序列；所述Asial型ロ蹄疫病毒的全长感染性cDNA克隆5’末端具有T7RNA聚合酶启动子序列，3’末端具有単一的限制性酶切位点；其中，所述的3’末端限制性酶切位点是EcoRV酶切位点或NotI酶切位点；5’末端上游具有SphI酶切位点。所述Asial型ロ蹄疫病毒的全长感染性cDNA克隆除了启动子，poly (A)序列和PoIy(C)序列之外，其余的核苷酸序列与ロ蹄疫 病毒基因组天然序列相差不超过6个核苷酸序列；所述Asial型ロ蹄疫病毒的全长感染性cDNA克隆的poly (C)结构具有14-20个聚合C，poIy(A)尾具有19-22个A(更优选为具有19个A) ；poIy(C)结构及其侧翼序列是通过RT-PCR直接扩增得到，利用FMDV基因组中自然存在的两个限制性内切酶识别位点，将获得的包含PoIy(C)结构的片段导入全长cDNA中。所述Asial型ロ蹄疫病毒的全长感染性cDNA以pBluescriptSK (+)为载体；进ー步优选的，所述Asial型ロ蹄疫病毒的全长感染性cDNA，包含SEQ ID NO 1所示的序列。一种构建上述Asial型江苏谱系ロ蹄疫病毒的全长感染性cDNA的方法，包括(I)以Asial型江苏谱系ロ蹄疫病毒RNA为模板，应用5’RACE方法扩增基因组的5’末端序列片段；(2)采用RT-PCR获得ロ蹄疫病毒基因组各部分的6个片段，包括poly (C)结构及其侧翼序列；(3)将所扩增的PCR片段采用限制性内切酶酶切克隆的方法组装克隆到质粒载体中，全长cDNA克隆5’末端具有T7RNA聚合酶启动子序列，3’末端具有単一的限制性酶切位点；(4)将所述cDNA各片段连接，构成带有基因组全长cDNA的质粒载体；纯化回收包含病毒基因组全长cDNA的质粒，即得。其中，步骤(I)所用到引物序列为SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :16所示；步骤(2)中所用到引物序列为 SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQID NO :12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO :14 所示；步骤(3)中所述的质粒载体是pBluescript II SK (+)载体；本专利技术的另ー目的是提供ー种Asial型ロ蹄疫病毒反向遗传操作系统,该Asial型ロ蹄疫病毒反向遗传操作系统由上述的Asial型江苏谱系ロ蹄疫病毒的全长感染性cDNA和表达T7RNA聚合酶的真核表达载体所组成。所述的表达T7RNA聚合酶的真核表达载体pT7RNAP，其构建方法包括将T7RNA聚合酶基因克隆到真核表达载体PCDNA3. I中，并在该基因的5'端引入Kozak序列，以确保T7RNA聚合酶的高效表达；同吋，为检测表达载体pT7RNAP是否表达pT7RNAP以及该酶是否具有转录活性，构建了以绿色荧光蛋白为检测信号的检测载体PT7-IRES-EGFP，该载体是利用FMDV的IRES能够介导非帽依赖性表达外源基因的特性，将FMDV的IRES和EGFP顺次克隆到原核表达载体PET-28a中，并使之受控于ロ蹄疫病毒的IRES元件下；把上述两个重组质粒共转染BHK-21细胞，培养20 48h，在紫外显微镜下观察，能够看到典型的绿色荧本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种Ａｓｉａ１型江苏谱系口蹄疫病毒的全长感染性ｃＤＮＡ，其特征在于：该全长感染性ｃＤＮＡ包含了保证合成口蹄疫病毒的转录本具有感染性所要求的ｐｏＩｙ（Ａ）序列和ｐｏＩｙ（Ｃ）序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：于力，王海伟，杨德成，涂亚斌，周国辉，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]
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