本发明专利技术公开了一种带有标签的肠道病毒71型全长感染性克隆的制备方法及应用，其步骤是：（1）总RNA的提取；（2）EV71的RT-PCR扩增；（3）EV71亚克隆的构建；（4）含有EV71基因的重组克隆的构建；（5）带有eGFP和DsRed的EV71全长感染性克隆的构建。通过细胞病变、荧光检测、基因检测、病毒蚀斑和药物抑制等实验证明成功获得带有标签的EV71全长感染性克隆。本发明专利技术在动物模型、病毒复制与致病机理、药物筛选和药物作用机制、疫苗和诊断试剂的研发等方面具有广泛的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
带有标签的肠道病毒71型全长感染性克隆的制备方法及应用
本专利技术属于生物
，更具体涉及一种分别带有eGFP和DsRed标签的肠道病毒71型全长感染性克隆的制备方法，及其在制备EV71病毒的能力及药物筛选中的应用。
技术介绍
肠道病毒71 型(Enterovirus 71，EV71)属于小 RNA 病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus)，其基因组为单股正链RNA，长度约为7. 5kb,编码约2200个氨基酸。基因组编码的多聚蛋白可切割成3个前体蛋白(P1、P2、P3)。其中，Pl前体蛋白可切割4种病毒结构蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)。P2和P3前体蛋白可切割为7个非结构蛋白 (2A、2B、2C、3A、;3B、3C、3D) ；P3区在进化过程中高度保守。ORF的两侧分别为5，和3，非编码区，另外在3’非编码区末端含有一个长度可变的多聚腺苷酸(polyA)。EV71的感染能够引起人的手足口病、疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎、脊髓灰质炎样麻痹等多种与神经系统相关的疾病，严重时可危及生命。其传播途径主要经由胃肠道或呼吸道传播，也可经由接触病人皮肤水泡的疱疹液而受到感染。自1974年，EV71被首次报道以来，已在马来西亚、澳大利亚、新加坡、日本，中国台湾和中国大陆等国家和地区爆发和流行。在我国，很多地区都曾有散发病例的报道，直到2008年EV71的爆发流行(手足口病病例488955例，死亡1 例)，才引起了整个社会的关注。因此，2008年4月，国家卫生部颁发了《肠道病毒(EV71)感染诊疗指南(2008版)》和《手足口病预防控制指南(2008版)》， 并在同年5月将手足口病纳入丙类法定传染病管理。2009年，我国部分地区手足口病病例呈现增多的趋势。针对严峻的现状，广大的科学工作者以EV71为对象，从病毒的生物学特性、致病机理、诊断试剂和疫苗的研究等方面做了大量的工作。但是，目前仍然缺乏特效的治疗手段。因此，继续深入的开展相关的研究，如病毒的分子生物学特性、复制机制、致病机理等，将有利于人类更加全面透彻的了解EV71，从而为设计有效的药物、准确的诊断方法和试剂以及良好的疫苗提供理论依据。随着分子生物学的不断发展，科学家已经能够通过反向遗传学的手段来定向改造病毒，为深入开展相关的病毒学研究提供了良好的工具。目前，该技术已经应用到了许多不同的病毒研究中，如西尼罗病毒，登革病毒，狂犬病毒，牛病毒性腹泻病毒等，建立了相应病毒的反向遗传学平台(全长感染性克隆)，以这些平台为基础开展了关于病毒的复制机制、 致病机理和疫苗的相关研究，并取得了突破性的进展。同时，相关的科学工作者在构建的全长感染性克隆的基础上进一步的设计了带有不同标签的全长感染性克隆。这一新的反向遗传学平台为开展相关的科学研究提供了相比于不带标签的病毒全长感染性克隆更便捷的优势。因此，本专利技术分别获得了带有eGFP和DsRed标签的EV71全长感染性克隆，为深入开展EV71的基础研究和应用研究提供了有效的平台。本专利技术具有十分重要的理论意义和现实意义，同时具有广泛的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种分别带有绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白标签的 EV71型全长感染性克隆构建方法，首先建立EV71全长感染性克隆(pACYC-EV71-FL)，然后采用双酶切的方法分别将eGFP基因和DsRed基因插入于低拷贝载体pACYC_EV71_FL中，从而分别获得带有eGFP标签的EV71全长感染性克隆和带有DsRed标签的EV71全长感染性克隆。将获得的EV71全长感染性克隆体外转录为RNA，并将其转染Vero细胞，并通过细胞病变的观察、eGFP的检测、DsRed的检测、病毒特定基因的检测和病毒蚀斑等方法证明了分别eGFP基因和DsRed基因的EV71全长感染性克隆具有稳定产生EV71的能力，产生的EV71 的生物学特性与亲代病毒相似。本专利技术的另一个目的是在于提供了一种分别带有绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白标签的EV71型全长感染性克隆在制备病毒的能力和药物筛选中的应用。EV71的感染能够引起人的手足口病、疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎、脊髓灰质炎样麻痹等多种与神经系统相关的疾病，严重时可危及生命。实验证明以构建的带有绿色荧光蛋白(eGFP)标签的EV71全长感染性克隆和带有红色荧光蛋白(DsRed)标签的EV71全长感染性克隆为平台，使用已知对EV71具有抑制作用的盐酸胍测试本专利技术所构建的平台在抗病毒药物筛选中的有效性， 结果表明本专利技术能够很好的应用抗病毒的药物筛选。另外，本专利技术也在研究EV71的动物模型、病毒的复制机制与致病机理、疫苗和诊断试剂的研发等方面具有广泛的应用价值。为了实现以上目的，本专利技术采用如下技术方案一种分别带有绿色荧光蛋白(eGFP)和红色荧光蛋白(DsRed)标签的EV71型全长感染性克隆的制备方法，其步骤是1.总RNA的提取￠( 140ul 的 EV71 ^(Yong Zhang, Jitao Wang, Wanshen Guo, Haiyan Wang, Shuangli Zhu, Dongyan Wang, Ruyin Bai, Xingle Li, Dongmei Yan, Huiling Wang, Yan Zhang, Zhen Zhu, Xiaojuan Tan, Hongqiu An, Aiqiang Xu, and Wenbo Xu. Emergence and Transmission Pathways of Rapidly Evolving Evolutionary BranchC4a Strains of Human Enterovirus 71 in the Central Plain of China. PLoS One. 2011 ；6 (11) e27895.)，按照QIAamp Viral RNA (购自Qiagen公司)试剂盒说明书的要求抽提EV71的总 RNA，使用 Thermo Scientific NanoDrop 2000 (购自 Thermo 公司)测定 RNA 的浓度，并使用浓度为(w/v)的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，于-80°C保存备用。2. EV71 的 RT-PCR 扩增将EV71的全基因组分成四个部分设计引物(这四个片段分别命名为F1、F2、F3和 F4)。以上述步骤1中的EV71的总RNA为模版，采用RT-PCR试剂盒(购自Takara公司) 分别获得DNA片段Fl、F2、F3和F4。片段的序列为SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3, SEQ ID N0:4所示。使用浓度为(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR产物，并使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(购自天根生化科技有限公司)分别回收DNA片断，使用Thermo ScientificNanoDrop 2000 (前面已述)测定DNA的浓度，使用浓度为1% (w/v)的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，并于_20°C保存备用。PCR仪为Biorad公司的MyCycler Thermal cycler，所用引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。DNA片段Fl的本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张波，史佩勇，许文波，袁志明，邓成林，商宝娣，贾凡，
申请(专利权)人：中国科学院武汉病毒研究所，
类型：发明
国别省市：
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