本发明专利技术公开了一种柑桔衰退病毒全长侵染性克隆的构建方法及试剂盒，属于生物技术领域。本发明专利技术针对柑桔衰退病毒分离株FS-577全序列，设计了6对特异性引物，这些引物的扩增区域涵盖了FS-577的全序列。将扩增片段经双酶切后依次插入到改造后的双元载体pUC119-Δ9后获得的全长侵染性克隆与野生型FS-577相比，在序列、侵染能力和寄主范围等性状上完全一致。利用该方法建立的试剂盒，包括有第一链cDNA合成、PCR扩增、双酶切缓冲液，以及链接反应缓冲液等，这些试剂盒可用于构建柑桔衰退病毒全长侵染性克隆。本发明专利技术为研究柑桔衰退病毒致病和蚜传等机理，以及柑桔衰退病防治提供了极其重要的技术平台。
【技术实现步骤摘要】
一种柑桔衰退病毒全长侵染性克隆的构建方法及试剂盒
本专利技术涉及一种病毒全长侵染性克隆的构建方法及试剂盒，尤其涉及一种柑桔衰退病毒全长侵染性克隆的构建方法及试剂盒，属于生物
。
技术介绍
中国的柑桔种植面积和产量均居世界第一。柑桔衰退病毒(Citrus tristezavirus，CTV)引起的柑桔衰退病是一种重要的世界性柑桔病害，通过蚜虫和带病苗木传播。我国广泛分布着柑桔衰退病毒的多种强毒株和强力传媒褐色桔蚜，随着20世纪80年代末我国开始进行柑桔产业结构调整，柚类和甜橙的种植比例增加，柑桔衰退病对柚类和某些甜橙的为害日益加剧。植物病毒侵染性载体是研究病毒功能基因组的至关重要的平台，在分子生物学水平上研究病毒基因组结构与功能以及寄主与病毒直接的互作，必须要获得病毒的侵染性克隆，在此基础上才能获得野生型分子或者突变型分子的均一群体，进而利用DNA重组技术进行突变、缺失、插入、置换以及互补实验对病毒基因组进行功能区域的定位，从而能在寄主植物表型水平上反映和评价基因功能的表达，该技术是深入研究病毒的基因功能以及病毒与寄主植物互作的有效手段。目前主要通过弱毒株交叉保护技术来防治柑桔衰退病，但是由于对柑桔衰退病毒的致病和蚜传机理，以及交叉保护作用原理的认识还不全面，因此在防治上还存在许多局限，影响了防治效果。构建柑桔衰退病毒全长侵染性克隆是进行上述研究的关键环节。由于柑桔衰退病毒基因组通常含有19296个核苷酸，是已知最大的植物病毒，病毒颗粒极易断裂，且缺乏适宜的草本寄主，因此构建全长侵染性克隆的难度极大。我国尚未开展此类研究。
技术实现思路
针对我国现有柑桔衰退病防治及研究中的瓶颈问题，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种柑桔衰退病毒全长侵染性克隆的构建方法及试剂盒。本专利技术所提供的柑桔衰退病毒全长侵染性克隆的构建方法，包括以下步骤:1)提取柑桔病株中柑桔衰退病毒分离株FS-577的总RNA ；2)以所述总RNA为模板，用随机引物反转录合成第一链cDNA ；3)用柑桔衰退病毒分离株FS-577的全序列设计的6对特异性引物，分段扩增所述步骤2中第一链cDNA的6个片段:cDNA片段1~6，所述的特异性引物的核苷酸序列分别为:弓丨物1上游引物序列ZYC214:5 ’ -CACTCGAGACAAACATCCCTGCCCAACGC-3，；弓丨物1下游引物序列ZYC1293:5， -GCAGGATCCGTCGTACAGGGATCGTAATTAC-3，；引物2上游引物序列ZYC749:5’ -AGTCCTCGAGAACCACTTAGTTGTTTAGCTATC-3’ ；弓丨物2下游引物序列ZYC1894:5’ -GCCGCACTAGTATTTAAATTGGACCTATGTTGGCCCCCCATAGGGACAGTG-3’ ；弓丨物3上游引物序列ZYC253:5’ -GTTCCGCATGCAGGAGTAAACACGTAGGTATGT-3’ ；弓丨物3下游引物序列ZYC1436:5’ -AGCTCCATGGTGGGGAGAAACGGATCTTCAT-3’ ；引物4 上游引物序列 ZYC126:5’ -CTTACTACGCCAACGCGAGCC-3’ ；弓丨物4下游引物序列ZYC1493:5， -GAGCCCGCAGGACGCTGTGGAAAGATGCGT-3，；弓丨物5上游引物序列ZYC431:5’ -GGTAGATCTAGCGCGGAACAATTTTTTTCA-3’ ；弓丨物5下游引物序列ZYC1478:`5， -GCGGCTGCAGCTCGCAACCCGCCAGGA-3，；弓丨物6上游引物序列ZYC2158:5’ -CGAACAGGTTCAATTTGTGAAATTCCTCTCCAAATGAAATG-3’ ；引物6 下游引物序列 ZYC114:5’ -CCGGAATTCAGGCAGCTTGGGAAAT-3’ ；4)将步骤3中扩增得到的cDNA片段I与双元载体pUC119_ Λ 9分别进行PmeI/PstI双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后得到35S-143 ;将35S-143与cDNA片段2分别进行Pstl/Swal双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后，得到35S-144 ;将35S-144与cDNA片段3分别进行Xmal/Pmel双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后得到35S-145 ;将35S-145与cDNA片段4分别进行XmaI/Bsu36I双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后得到35S-146 ;将35S-146与cDNA片段5分别进行Rsr II/Bsu36I双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后，得到35S-147 ;将35S-147与cDNA片段6分别进行Rsr II/AscI双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后，得到柑桔衰退病毒全长侵染性克隆35S-148。所选的酶切位点使得扩增片段可以成功地插入双元载体PUC119-A9中。所述步骤4中的双元载体为PUC119-A9，使用该双元载体可极大的提高柑桔衰退病毒全长克隆的侵染能力。通过生物学验证表明，35S-148具有侵染能力不仅能侵染草本植物本生烟，还能侵染大翼来檬等不同的柑桔品种。由此证明本专利技术构建的35S-148是柑桔衰退病毒FS-577的全长侵染性克隆，具有与FS-577相同的侵染能力和寄主范围。该全长侵染性克隆为研究柑桔衰退病毒致病和蚜传等机理，以及柑桔衰退病防治提供了极其重要的技术平台。所述步骤3 中 PCR 扩增的反应条件为 94°C 2min ；94°C 30sec，58°C 45sec，72°C，4min循环35次；最后72°C延伸lOmin，终止反应。本专利技术还提供了一种柑桔衰退病毒全长侵染性克隆的试剂盒，包括:柑桔衰退病毒分离株FS-577全序列扩增的6对引物:弓丨物1上游引物序列ZYC214:5， -CACTCGAGACAAACATCCCTGCCCAACGC-3，；弓丨物1下游引物序列ZYC1293:5， -GCAGGATCCGTCGTACAGGGATCGTAATTAC-3，；[0041 ]弓丨物2上游引物序列ZYC749:5’ -AGTCCTCGAGAACCACTTAGTTGTTTAGCTATC-3’ ；引物2下游引物序列ZYC1894:5’ -GCCGCACTAGTATTTAAATTGGACCTATGTTGGCCCCCCATAGGGACAGTG-3’ ；弓丨物3上游引物序列ZYC253:5’ -GTTCCGCATGCAGGAGTAAACACGTAGGTATGT-3’ ；弓丨物3下游引物序列ZYC1436:5， -AGCTCCATGGTGGGGAGAAACGGATCTTCAT-3，；引物4 上游引物序列 ZYC126:5’ -CTTACTACGCCAACGCGAGCC-3’ ；弓丨物4下游引物序列ZYC1493:5， -GAGCCCGCAGGACGCTGTGGAAAGATGCGT-3，；弓丨物5上游引物序列ZYC本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种柑桔衰退病毒全长侵染性克隆的构建方法，包括以下步骤：?1）提取柑桔病株中柑桔衰退病毒分离株FS?577的总RNA；?2）以所述总RNA为模板，用随机引物反转录合成第一链cDNA；?3）用柑桔衰退病毒分离株FS?577的全序列设计的6对特异性引物，分段扩增所述步骤2中第一链cDNA的6个片段：cDNA片段1～6，所述的特异性引物的核苷酸序列分别为：?引物1上游引物序列ZYC214：?5’?CACTCGAGACAAACATCCCTGCCCAACGC?3’；?引物1下游引物序列ZYC1293：?5’?GCAGGATCCGTCGTACAGGGATCGTAATTAC?3’；?引物2上游引物序列ZYC749：?5’?AGTCCTCGAGAACCACTTAGTTGTTTAGCTATC?3’；?引物2下游引物序列ZYC1894：?5’?GCCGCACTAGTATTTAAATTGGACCTATGTTGGCCCCCCATAGGGACAGTG?3’；?引物3上游引物序列ZYC253：?5’?GTTCCGCATGCAGGAGTAAACACGTAGGTATGT?3’；?引物3下游引物序列ZYC1436：?5’?AGCTCCATGGTGGGGAGAAACGGATCTTCAT?3’；?引物4上游引物序列ZYC126：5’?CTTACTACGCCAACGCGAGCC?3’；?引物4下游引物序列ZYC1493：?5’?GAGCCCGCAGGACGCTGTGGAAAGATGCGT?3’；?引物5上游引物序列ZYC431：?5’?GGTAGATCTAGCGCGGAACAATTTTTTTCA?3’；?引物5下游引物序列ZYC1478：?5’?GCGGCTGCAGCTCGCAACCCGCCAGGA?3’；?引物6上游引物序列ZYC2158：?5’?CGAACAGGTTCAATTTGTGAAATTCCTCTCCAAATGAAATG?3’；?引物6下游引物序列ZYC114：5’?CCGGAATTCAGGCAGCTTGGGAAAT?3’；?4）将步骤3中扩增得到的cDNA片段1与双元载体pUC119?Δ9分别进行PmeI/PstI双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后得到35S?143；将35S?143与cDNA片段2分别进行PstI/SwaI双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后，得到35S?144；将35S?144与cDNA片段3分别进行XmaI/PmeI双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后得到35S?145；将35S?145与cDNA片段4分别进行XmaI/Bsu36I双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后得到35S?146；将35S?146与cDNA片段5分别进行Rsr?II/Bsu36I双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后，得到35S?147；将35S?147与cDNA片段6分别进行Rsr?II/AscI双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后，得到柑桔衰退病毒全长侵染性克隆35S?148。...
【技术特征摘要】
1.一种柑桔衰退病毒全长侵染性克隆的构建方法，包括以下步骤: 1)提取柑桔病株中柑桔裳退病毒分尚株FS-577的总RNA； 2)以所述总RNA为模板，用随机引物反转录合成第一链cDNA； 3)用柑桔衰退病毒分离株FS-577的全序列设计的6对特异性引物，分段扩增所述步骤2中第一链cDNA的6个片段:cDNA片段I~6,所述的特异性引物的核苷酸序列分别为: 引物I上游引物序列ZYC214 :5’ -CACTCGAGACAAACATCCCTGCCCAACGC-3’ ； 引物I下游引物序列ZYC1293:5’ -GCAGGATCCGTCGTACAGGGATCGTAATTAC-3’ ； 引物2上游引物序列ZYC749:5’ -AGTCCTCGAGAACCACTTAGTTGTTTAGCTATC-3’ ； 引物2下游引物序列ZYC1894:5’ -GCCGCACTAGTATTTAAATTGGACCTATGTTGGCCCCCCATAGGGACAGTG-3’ ； 引物3上游引物序列ZYC253:5’ -GTTCCGCATGCAGGAGTAAACACGTAGGTATGT-3’ ； 引物3下游引物序列ZYC1436:5’ -AGCTCCATGGTGGGGAGAAACGGATCTTCAT-3’ ； 引物 4 上游引物序列 ZYC126:5’ -CTTACTACGCCAACGCGAGCC-3’ ； 引物4下游引物序列ZYC1493:5’ -GAGCCCGCAGGACGCTGTGGAAAGATGCGT-3’ ； 引物5上游引物序列ZYC431:5’ -GGTAGATCTAGCGCGGAACAATTTTTTTCA-3’ ； 引物5下游引物序列ZYC1478:5， -GCGGCTGCAGCTCGCAACCCGCCAGGA-3，； 引物6上游引物序列ZYC2158:5’ _CGAACAGGTTCAATTTGTGAAATTCCTCTCCAAATGAAATG-3’ ； 引物 6 下游引物序列 ZYCl 14:5’ -CCGGAATTCAGGCAGCTTGGGAAAT-3’ ； 4)将步骤3中扩增得到的cDNA片段I与双元载体pUC119-Δ 9分别进行Pmel/PstI双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后得到35S-143 ；将35S-143与cDNA片段2分别进行Pstl/Swal双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后，得到35S-144 ;将35S-144与cDNA片段3分别进行Xmal/Pmel双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后得到35S-145 ;将35S-145与cDNA片段4分别进行XmaI/Bsu36I双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后得到35S-146 ;将35S-146与cDNA片段5分别进行Rsr II/Bsu36I双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后，得到35S-147 ;将35S-147与cDNA片段6分别进行Rsr II/AscI双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后，得到柑桔衰退病毒全长侵染性克隆35S-148。2.根据权利要求1所述的一种柑桔衰...
【专利技术属性】
技术研发人员：周彦，周常勇，李中安，
申请(专利权)人：中国农业科学院柑桔研究所，
类型：发明
国别省市：
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