本发明专利技术公开一种乙型脑炎病毒弱毒株重组感染性克隆质粒，包含乙型脑炎病毒弱毒株10S3的全长基因组cDNA序列，或乙型脑炎病毒弱毒株10S3的全长基因组cDNA序列内部引入标记性酶切位点的全长cDNA序列。本发明专利技术还公开了一种乙型脑炎病毒感染性克隆弱毒株，该弱毒株是乙型脑炎病毒弱毒株10S3的克隆毒株，所述弱毒株10S3的全长基因cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术的乙型脑炎病毒弱毒株重组感染性克隆质粒，在细胞上拯救出的乙型脑炎病毒感染性克隆弱毒株，在免疫动物后能对动物抵抗乙型脑炎病毒提供完全的免疫保护，非常有利于乙型脑炎病毒的预防和控制。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开一种乙型脑炎病毒弱毒株重组感染性克隆质粒，包含乙型脑炎病毒弱毒株10S3的全长基因组cDNA序列，或乙型脑炎病毒弱毒株10S3的全长基因组cDNA序列内部引入标记性酶切位点的全长cDNA序列。本专利技术还公开了一种乙型脑炎病毒感染性克隆弱毒株，该弱毒株是乙型脑炎病毒弱毒株10S3的克隆毒株，所述弱毒株10S3的全长基因cDNA序列如SEQ?ID?NO.1所示。本专利技术的乙型脑炎病毒弱毒株重组感染性克隆质粒，在细胞上拯救出的乙型脑炎病毒感染性克隆弱毒株，在免疫动物后能对动物抵抗乙型脑炎病毒提供完全的免疫保护，非常有利于乙型脑炎病毒的预防和控制。【专利说明】乙型脑炎病毒弱毒株重组感染性克隆质粒及其应用
本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及一种乙型脑炎病毒弱毒株重组感染性克 隆质粒及其应用。
技术介绍
乙型脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus, JEV)是一种重要的人畜共患病 病原，属黄病毒科黄病毒属（Flavivirus)，该属重要成员还包括黄热病毒（Yellow Fever Virus, YFV)、登革病毒（Dengue Virus, DENV)和西尼罗河病毒（West nile virus, WNV)等。 JEV基因组是一单股正义RNA，有5'帽、无3'多聚腺苷尾，全长约llkb。基因组编码单一 长开放阅读框，两侧是5'非编码区（5' -untranslated region, 5' -UTR)和3'非编码区 (3' -UTR)。单个长开放阅读框翻译产生一个多聚蛋白，多聚蛋白在翻译中或翻译后裂解成 10个蛋白。N端占多聚蛋白长度四分之一的序列编码结构蛋白（C-prM-E)，其余部分是非结 构蛋白（NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5)。依据E蛋白基因序列，可将JEV分成五个基 因型（genotype)。 JEV由蚊传播，可感染人和马、猪、野生水禽等多种动物。感染人和马，主要呈现脑 炎神经症状。人感染发病后，死亡率可高达20%，而幸存者大多留有脑炎后遗症，危害甚重。 而猪只不分大小均可感染该病毒，临床可表现出新生仔猪脑炎和种猪繁殖障碍，如流产、死 胎和睾丸炎，给养猪业造成重大经济损失。其它动物则表现为隐性感染。猪在JEV循环传 播中也起重要作用，猪不仅是中间宿主，还是JEV传播的扩增器。猪感染JEV后，病毒血症 持续的时间长，病毒滴度高，吸食猪血的蚊都可被感染成为带毒蚊，从而扩大蚊对JEV的传 播。因此，必须加强对猪群中JEV的防治工作。 我国是JEV的主要流行地区，目前除青海未报道外，其他各省市均存在JEV流行， 每年JE病例在数千例以上。分子流行病学调查显示，1978年前我国流行的JEV均属基因 III 型（Genotype III，GIII)，但 1978 年出现首株基因 I (Genotype I，GI)，在随后的 20 年 间我国处于GI和GIII共流行的态势。近年来，我国从脑炎患者、猪、蚊体内分离出多株GI， GI JEV流行呈上升趋势。疫苗接种是预防JE的有效途径。目前，我国普遍给儿童接种JEV 疫苗株SA14-14-2,而猪用JEV疫苗株也为SA14-14-2。SA14-14-2是由SA14株致弱而来， 同属GIII。研究显示，GIII疫苗诱导抗体，对GI JEV仅具有部分中和能力。因此，需要开 发新的兽用疫苗，来预防猪群中JEV的流行。 自上世纪八十年代以来，病毒感染性克隆技术的兴起和发展极大地促进了病毒的 研究。由于感染性克隆技术可以直接操作病毒基因组序列，可以根据研究者的目的改变病 毒的遗传序列，已逐渐成为研究病毒基因组复制与表达、病毒蛋白的功能、病毒与宿主间的 相互作用、构建新型病毒载体和研制新型疫苗的重要平台。但在利用感染性克隆技术研究 JEV过程中，存在一大障碍就是JEV基因组cDNA克隆在宿主菌中不稳定，容易产生核苷酸缺 失、插入等突变现象，导致病毒的感染性克隆难以建立。
技术实现思路
本专利技术要解决目前预防乙型脑炎的GIII疫苗诱导的抗体对GI型JEV仅具有部分 中和能力，急需开发新的乙脑兽用疫苗的技术问题，提供一种乙型脑炎病毒弱毒株重组感 染性克隆质粒，通过该重组感染性克隆质粒拯救出的感染性JEV病毒，在免疫小鼠后可使 小鼠抵抗乙型脑炎病毒GI株的攻击，为动物提供完全的免疫保护，适于开发成乙型脑炎病 毒感染性克隆弱毒疫苗株。 此外，还需要提供一种上述乙型脑炎病毒弱毒株重组感染性克隆质粒的应用。 为了解决上述技术问题，本专利技术通过如下技术方案实现： 在本专利技术的一个方面，提供了一种重组质粒，包含：乙型脑炎病毒弱毒株10S3的 全长基因 cDNA序列，该弱毒株10S3的全长基因 cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示。 在本专利技术的一个方面，提供了一种重组质粒，包含：乙型脑炎病毒弱毒株10S3的 全长基因 cDNA序列内部引入标记性酶切位点的全长cDNA序列，该弱毒株10S3的全长基因 cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示。 优选的，所述弱毒株10S3的全长基因 cDNA序列内部引入的标记性酶切位点是通 过定点突变将该弱毒株10S3的全长基因第9291位碱基C突变成G而引入的SacII酶切位 点。 优选的，所述全长基因 cDNA序列5'末端还加设有T7启动子；所述全长基因 cDNA 序列3'末端还加设有丁型肝炎病毒核酶序列（HDVr序列)。 在本专利技术的另一方面，提供了一种感染性克隆弱毒株，所述感染性克隆弱毒株是 通过将上述重组质粒线性化，再将该线性化的全长CDNA体外转录成RNA后转染细胞而获得 的感染性乙型脑炎病毒。 在本专利技术的另一方面，还提供了一种乙型脑炎病毒弱毒株，所述乙型脑炎病毒弱 毒株的全长基因 cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示。 在本专利技术的另一方面，还提供了一种上述感染性克隆弱毒株在制备预防乙型脑炎 的疫苗中的应用。 在本专利技术的另一方面，还提供了一种上述乙型脑炎病毒弱毒株在制备预防乙型脑 炎的疫苗中的应用。 在本专利技术的另一方面，还提供了一种上述感染性克隆弱毒株在制备区分乙型脑炎 疫苗免疫毒株与自然感染毒株的产品中的应用。 在本专利技术的另一方面，还提供了一种区分乙型脑炎的感染性克隆疫苗株与自然感 染毒株的检测试剂盒，包含：针对引入的标记性酶切位点设计的特异性引物、标记性的限制 性内切酶。 利用针对引入的标记性酶切位点设计合成的特异性引物，通过RT-PCR及进一步 的限制性酶切，可以有效区分出乙型脑炎的感染性克隆疫苗株与自然感染毒株。 优选的，针对引入的位于病毒基因组9287-9292位核苷酸的SacII酶切位点设计 特异性引物。 本专利技术乙型脑炎病毒弱毒株重组感染性克隆质粒，在细胞上拯救出的乙型脑炎病 毒感染性克隆弱毒株，不仅在免疫动物后能对动物抵抗乙型脑炎病毒提供完全的免疫保 护，而且能有效区分乙型脑炎疫苗免疫动物与乙型脑炎病毒自然感染动物，满足临床上对 乙型脑炎病毒疫苗免疫毒株与自然感染毒株的鉴别诊断，非常有利于乙型脑炎病毒的预防 和控制，应用前景十分广阔。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组质粒，其特征在于，包含：乙型脑炎病毒弱毒株10S3的全长基因cDNA序列，该弱毒株10S3的全长基因cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郑浩，童光志，郑旭晨，童武，马志永，郭亦非，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31
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