猫杯状病毒感染性克隆及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了猫杯状病毒感染性克隆，通过在FCV病毒的全长cDNA的两端连接酶切位点，之后将序列连接到表达载体中得到。实验结果表明，使用本发明专利技术克隆生产得到的FCV，与亲本毒具有相似的特性，具有很好地感染性，可使细胞明显变性，滴度高，传代稳定。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种正义RNA病毒表达载体及其构建方法和应用，特别涉及一种猫杯状病毒感染性克隆及其构建方法和应用。
技术介绍
单股正链RNA病毒的碱基序列与mRNA完全相同，可直接起到病毒mRNA的作用。因此，该类病毒称为正义RNA病毒，其裸RNA具有感染性。该类病毒基因组复制的特点是先合成(-)RNA，再以之作为合成(+)RNA的模板。Racaniello和Baltimore于1981年首次成功的构建了动物RNA病毒的感染性克隆，他们把脊髓灰质炎病毒(Poliovirus，PV)基因组的全长cDNA克隆到pBR322载体中，用该重组质粒转染哺乳动物细胞后，可以产生具有感染性的病毒粒子，从此拉开了动物RNA病毒反向遗传学研究的序幕。随后其它一些正链RNA病毒的反向遗传学系统也在不断被成功建立。Sumiyoshi等(1992)采用分段克隆的方法成功拯救了日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus JEV)。分段克隆即将黄病毒的全基因组分成两段或者多个片段构成重组质粒然后体外连接成全长cDNA分子，再进行体外转录或拯救，以此解决了黄病毒科中一些病毒基因组cDNA的亚克隆在寄主细菌中常不能稳定增殖的问题。FMDV的第一个感染性cDNA由Zibert A等于1990年构建成功，随后 Riederd等也成功构建了 A型FMDV的感染性克隆，他们各自采用不同的方法克服了 FMDV基因组中Poly(C)尾巴的问题。AlmaZ(5n(2000)等利用BAC系统首次成功构建出了猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis coronavirus TGEV)的全长cDNA分子克隆， 并实现了病毒拯救。这是反向遗传学发展史上的一个突破性进展，TGEV感染性克隆的成功构建表明RNA病毒的反向遗传学操作将不再受到基因组大小的限制。2006年，St-Jean等利用BAC系统又成功拯救出具有神经毒力的人冠状病毒(Human corona virus，HCoV)。此外， Casais等0001)率先利用痘病毒做载体成功构建了鸡传染性支气管炎病毒Gnfectious bronchitis virus, IBV)的反向遗传研究系统，为建立其它冠状病毒的感染性克隆提供了范例。其后，Thiel等Q001)也将人冠状病毒的全长cDNA克隆到痘病毒载体中，并能稳定的增值病毒cDNA。Yount等^00 在体外采用顺次连接的方法获得了 MHV的全长cDNA，以其为模板进行体外转录，获得了具有感染性的全长RNA。这种策略虽然可行，但是存在RNA 获得率低，病毒拯救效率低的缺陷。Coley等000 将体外装配好的鼠肝炎病毒(Mouse hepatitis virus, MHV)的全长cDNA分子克隆至痘苗病毒载体中，然后用豆苗病毒感染靶细胞，通过体内转录过程实现了 MHV的拯救，用该方法拯救出的病毒不仅滴度高，而且具有很强的侵略性，与母本毒相似。至此冠状病毒的反向遗传学研究系统已经完全走向成熟。猫杯状病毒(Feline Calicivirus，FCV)，属于杯状病毒科，是一种正链RNA病毒。 是猫上呼吸道疾病的主要病原，主要引起猫的急性口腔溃疡、上呼吸道感染和慢性胃肠炎疾病，该病发病率较高，但死亡率较低。几乎所有的猫科动物对FCV都易感。一岁以下的猫最易感，潜伏期为2 3天，病猫临床症状表现为采食困难、打喷嚏、流涎、口腔溃疡、结膜炎等。有些毒株可以引起急性关节炎，猫表现出跛行。FCV呈世界性分布，可能感染所有的猫科动物。自首次在猫身上分离到该病毒后，之后从猎豹和老虎体内也分离到该病毒。猫杯状病毒属于杯状病毒科，杯状病毒科现有四个属兔病毒属(Lagovirus)、诺瓦克病毒属(Norovirus)、扎幌样病毒属(Sappovirus)、以及水泡疹病毒属(Vesirus)。其中诺瓦克样病毒和扎幌样病毒合称人类杯状病毒(Human calicivirus HuCV)，它们是引起成人和儿童非细菌性急性胃肠炎的主要病原体，HuCV不仅可以引发肠道感染，也能引起心肌损害。而兔病毒属的主要成员兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus RHDV) 则是一种烈性毁灭性病毒性传染病，已经列入二类动物病原微生物，对养兔业和实验兔危害极大。尽管此类病毒已发现很多年，但由于缺乏相应的细胞培养系统，使得相关研究仍然缓慢。同科的猫杯状病毒却能够在猫肾细胞(CRH0中培养增殖。因此科学家们以它作为研究模型，试图解决目前存在的问题，现对FCV的分子生物学及反向遗传学的研究进展进行综述。在RNA病毒家族中，杯状病毒是一类不易引起人们重视的病毒。随着其重要成员偌瓦克病毒(NV)的发现，人们才开始重视该科病毒的研究。因为它可以引起人类的非细菌性肠胃炎，对人类的健康威胁极大。遗憾的是该科的大多数病毒都不能在体外培养，给病毒的分离和研究带来很大不便。反向遗传学技术的兴起给研究这些病毒带来了希望。但水泡疹样病毒属(如FCV)例外，它可以在CRFK(猫肾细胞)中高滴度的增殖，因此它往往被作为杯状病毒研究的模型。Manislav V. Sosnovtsev(1995)等最早利用RT-PCR的方法克隆了 FCVUrbana株的全基因组，运用T7RNA聚合酶启动子在体外转录了 FCV mRNA,同时在5'-端加上帽状结构，恢复了具有感染性的FCV病毒粒子。Kyeong-OK Chang等采用同样的方法恢复了具有感染性的猪的杯状病毒。Jorg Oliver Thumfart等采用体外转录的方法和构建真核表达质粒的方法，都成功恢复了 FCV病毒粒子。并且把绿色荧光蛋白基因 (GFP)插入FCV衣壳蛋白基因位置后，构建了感染性嵌合DNA克隆质粒，转录细胞GFP获得了表达，嵌合病毒基因组可自我复制，并且被包装成病毒粒子。但是，现有的猫杯状病毒感染性克隆普遍感染性不高，滴度较低。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新型的猫杯状病毒感染性克隆。本专利技术的另一个目的在于提供上述猫杯状病毒感染性克隆的构建方法。本专利技术的再一个目的在于提供上述猫杯状病毒感染性克隆在表达外源蛋白中的应用。本专利技术所采取的技术方案是猫杯状病毒感染性克隆，通过在FCV病毒的全长cDNA的两端连接酶切位点，之后将序列连接到表达载体中得到。表达载体为去除了 f 1、ori、SV40、neo、ρ 1 yA序列的商品化质粒pcDNA3，优选的，表达载体的3’端连接有核酶。核酶优选为自剪切型核酶。上述猫杯状病毒感染性克隆的构建方法，包括以下步骤1)使用PCR法扩增FCV全长cDNA，并在两端引入酶切位点；2)将商品化质粒pcDNA3的fl、ori、SV40、neo、plyA序列去除，得到改造质粒；3)在改造质粒上引入核酶序列；4)克隆出FCV全长基因组并连接到真核表达载体ρ⑶NA中，得到猫杯状病毒感染性克隆。优选的，引入核酶序列时包括如下步骤1)以PCDNA3为模板以DNA3HDRZ1和DNAIBB为引物，进行PCR，PCR程序是95°C5min ； 98°C 10s，55°C 15s，72°C 4min，30 个循环；72°C lOmin，得到 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：向华，徐敏，黄元，陈晶，
申请(专利权)人：广东省农业科学院兽医研究所，
类型：发明
国别省市：