本发明专利技术属于兽用生物制品技术领域。具体涉及一种猪源BVDV‑2毒株感染性cDNA克隆及应用。所述包含了猪源BVDV‑2种毒全长cDNA，所述猪源BVDV‑2种毒全长cDNA 5’末端插入T7 RNA聚合酶启动子、3’末端插入SbfI限制性内切酶。本发明专利技术还公开了含有所述猪源BVDV‑2毒株感染性cDNA的质粒pASH28，该质粒线性化后，体外转录成RNA，并转染MDBK细胞，能成功拯救出牛病毒性腹泻病毒。这种猪源BVDV‑2感染性cDNA克隆可用于研究不同动物源BVDV蛋白之间的功能差异，也可用于遗传改造制备高效价减毒BVDV疫苗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于兽用生物制品
具体涉及一种猪源BVDV-2毒株感染性cDNA克隆的构建方法及应用。
技术介绍
BVDV的宿主谱非常广，除了能感染牛，还可引起猪、羊、鹿、骆驼和多种野生动物发病。但直到2012年，世界动物卫生组织(OIE)才将该病列为必须通报的疾病之一。猪感染BVDV不表现出临床症状，或出现类似于猪瘟的症状，因而不仅给猪瘟的预防和控制带来了很大的困难，也使BVDV的防控难上加难。目前，国内猪群中BVDV的感染现状较为严重，已成为一个不容忽视的问题。卫秀余等在2005～2009年间，对国内20多个省市300多个规模化养猪场进行了BVDV的流行病学调查，发现各年度的BVDV阳性率分别为22.2％、43.1％、46.4％、66.7％和80.8％，呈逐年扩增的趋势且势态严重。邓宇等利用套式RT-PCR在2007～2010年对国内部分地区的临床样品进行筛查，检出BVDV的阳性率分别为23.1％(2007年)、27.7％(2008年)、33.6％(2009年)和23.6％(2010年)。梁晟等对2010～2012年广西部分地区猪病进行调查，结果表明BVDV的检出率为26.92％。BVDV和CSFV、BDV存在广泛的交叉感染，因此，不仅给BVDV的诊断和防制带来了困难，而且也混淆了CSFV和BDV的检疫。目前，国外对BVDV的防控主要采用疫苗注射，加强监测，淘汰免疫耐受及持续感染的动物。而在国内，BVDV感染主要以持续感染和免疫耐受等隐性感染为主，因此BVDV的防控应着重在于排除这种隐性感染动物。反向遗传学技术最具潜力的应用在于新型疫苗株的研制，通过在cDNA水平对基因组进行修饰，可以开发出高效而安全的标记疫苗。此外，利用这一技术还可在病毒基因组中插入外源基因序列，从而使RNA病毒成为疫苗和基因治疗的载体。因此，该技术也为我们深入研究牛源BVDV和猪源BVDV的感染机制及防控提供了有效技术平台。目前，国内对BVDV的研究相对滞后，一方面由于人们对该病的重视度不够，另一方面由于深入研究该病毒的技术平台太少。而感染性克隆的成功构建给我们提供了一个便利而有效的工具，让我们可以从分子水平对病毒基因组加以修饰和分析，从而进一步深入了解其基因功能及疾病机制。虽然，目前已成功构建多株BVDV分离株的感染性克隆，但这些都是针对牛源BVDV分离株的，至今为止还没有猪源BVDV-2感染性克隆的构建。因此，本研究首次构建了猪源BVDV-2分离株SH-28的感染性克隆，为后续猪源BVDV的相关研究建立了一个平台。
技术实现思路
本专利技术的首要目的是提供一种猪源BVDV-2感染性cDNA，为后续体外修饰RNA、猪源BVDV-2感染机制、不同动物源和基因型BVDV的蛋白功能差异研究提供一个有效的技术平台。本专利技术所述的猪源BVDV-2感染性cDNA，包含了猪源BVDV-2种毒全长、在该cDNA5’末端插入T7RNA聚合酶启动子、在cDNA3’末端插入SbfI限制性内切酶。本专利技术还公开了包含猪源BVDV-2毒株感染性cDNA克隆及在该基因组cDNA的5’末端插入T7RNA聚合酶I启动子序列，在3’末端插入SbfI限制性内切酶的质粒pASH28及其构建。所述的pASH28的构建方法是：提取猪源BVDV-2分离株SH-28的总RNA，以SEQIDNo.1-18为引物通过RT-PCR方法扩增其基因组的9个cDNA片段：SHA、SHB、SHC、SHD、SHE、SHF、SHG、SHH、SHI，所述9个片段分别克隆至pMD19TSimple载体中得到pMD-A、pMD-B、pMD-C、pMD-D、pMD-E、pMD-F、pMD-G、pMD-H和pMD-I；将pMD-D(SphI+BglI)、pMD-E(BglI+EcoRV)和pBR322(SphI+EcoRV)进行三片段连接，获得pBR-DE；然后将pMD-C(PshAI+SphI)连入pBR-DE(PshAI+SphI)，获得pBR-CDE；同时将pMD-A(EagI+SphI)、pMD-B(SphI+PshAI)和pBR322(EagI+PshAI)进行三片段连接，获得pBR-AB；最后将pBR-AB(EagI+PshAI)连入pBR-CDE(EagI+PshAI)，构建5’大片段pBR-AE；然后将pMD-F(EcoRV+SacI)和pMD-G(SacI+XbaI)连入pACYC184(EcoRV+XbaI)，构建pAC-FG；同时将pMD-H(XbaI+NheI)和pMD-I(NheI+ClaI)共同连入pACYC184(XbaI+ClaI)，获得pAC-HI；将pAC-FG(EcoRV+XbaI)与pAC-HI(EcoRV+XbaI)相互连接，获得3’大片段pAC-FI；最终将pBR-AE(EagI+EcoRV)和pAC-FI(EagI+EcoRV)相互连接，获得全长cDNA感染性克隆质粒pASH28。为保证病毒全长感染性克隆的稳定性，我们选用低拷贝载体pACYC184来进行构建，并利用PCR技术在SH-28基因组的5’末端和3’末端分别引入T7启动子序列和一个单一的SbfI酶切位点。基于全长转录本5’端和3’端的改变对感染性有一定的影响，在设计时将T7启动子序列精确置于5’端；此外，SbfI酶切位点的序列为CCTGCA/GG，与SH-28基因组3’末端具有共同的“C”，一方面减少了冗余碱基的引入，另一方面使质粒线性化，转录到3’端能够正确终止。为保证病毒基因组的准确性，反转录和PCR过程中分别选用SuperScriptFirst-StrandSynthesisSystemforRT-PCR(Invitrogen)和ExpandlongtemplatePCRsystem(Roche)。但该全长cDNA感染性克隆pASH28在基因组3978bp处存在一个核苷酸突变，经多次克隆和测序的结果都是一致的。该位点的突变导致了一个新的酶切位点AseI的出现，我们没有纠正该突变，而是将其作为区分拯救病毒和父本病毒的一个遗传标记。经间接免疫荧光检测和RT-PCR鉴定，发现随着传代次数的增加，拯救病毒vASH的病毒滴度逐渐增加，且到第5代以后达到稳定状态。在不断的传代过程中拯救病毒基因组中没有丢失AseI酶切位点，说明其遗传特性稳定。以上数据证实我们以猪源BVDV-2分离株SH-28为模板，成功建立了SH-28的全长cDNA感染性克隆平台。在本研究中，为了提高拯救病毒的病毒滴度，我们选用带毒传代的方法进行拯救病毒的培养。但间接免疫荧光鉴定结果显示，感染第1代vASH的细胞孔中只有少量的绿色荧光，而感染第3代vASH的细胞孔中的绿色荧光也才达到一半，说明病毒增殖效果不是很理想，虽然vASH传到第5代以后，其病毒滴度达到了稳定，且vASH的病毒滴度增长趋势也和亲本病毒的病毒滴度增长趋势相一致。我们推测可能是因为在24孔细胞板中进行病毒传代导致的，由于24孔细胞板的孔面积较小，而每次传代时孔内细胞铺的数量太多，导致细胞在短时间内即长成单层，生长受到限制，从而使得病毒不能在细胞内很好的增殖。因此，在病毒拯救过程中，选择正确的病毒传代方法也很重要。该质粒线性化后，体外转录成RNA，并转染MDBK细本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种含有猪源BVDV‑2毒株感染性cDNA的质粒，其特征在于该质粒是pASH28，包含了猪源BVDV‑2毒株感染性cDNA克隆，在该基因组cDNA的5’末端插入T7 RNA聚合酶I启动子序列，在3’末端插入SbfI限制性内切酶。
【技术特征摘要】
1.一种含有猪源BVDV-2毒株感染性cDNA的质粒，其特征在于该质粒是pASH28，包含了猪源BVDV-2毒株感染性cDNA克隆，在该基因组cDNA的5’末端插入T7RNA聚合酶I启动子序列，在3’末端插入SbfI限制性内切酶。2.权利要求1所述含有猪源BVDV-2毒株感染性cDNA的质粒pASH28的构建方法，其特征在于其步骤如下：提取猪源BVDV-2分离株SH-28的总RNA，以SEQIDNo.1-18为引物通过RT-PCR方法扩增其基因组的9个cDNA片段：SHA、SHB、SHC、SHD、SHE、SHF、SHG、SHH、SHI，所述9个片段分别克隆至pMD19TSimple载体中得到pMD-A、pMD-B、pMD-C、pMD-D、pMD-E、pMD-F、pMD-G、pMD-H和pMD-I；将pMD-D、pMD-E和pBR322进行三片段连接，获得pBR-DE；然后将pMD...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱国强，陶洁，王建业，朱礼倩，张信军，夏芃芃，孟霞，羊扬，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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