表达传染性喉气管炎病毒gB蛋白的重组新城疫病毒（NDV）疫苗株rAI4-gB及其构建方法，所述新城疫疫苗株rAI4-gB，它的保藏号CGMCC?No：8053。其构建方法是利用已建立的基因VII型NDV致弱毒AI4株的反向遗传操作平台，将SEQ?ID?NO.7所示的序列插入AI4株基因组全长转录载体pNDV/AI4中，得到含有传染性喉气管炎病毒gB基因的重组新城疫病毒基因组全长cDNA克隆pNDV/AI4-gB。经转染获得的重组病毒rAI4-gB在鸡胚上具有较高的繁殖滴度，连续传代仍能稳定表达gB蛋白，适合于疫苗的大规模生产，可用于制造疫苗。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】表达传染性喉气管炎病毒gB蛋白的重组新城疫病毒（NDV）疫苗株rAI4-gB及其构建方法，所述新城疫疫苗株rAI4-gB，它的保藏号CGMCC?No：8053。其构建方法是利用已建立的基因VII型NDV致弱毒AI4株的反向遗传操作平台，将SEQ?ID?NO.7所示的序列插入AI4株基因组全长转录载体pNDV/AI4中，得到含有传染性喉气管炎病毒gB基因的重组新城疫病毒基因组全长cDNA克隆pNDV/AI4-gB。经转染获得的重组病毒rAI4-gB在鸡胚上具有较高的繁殖滴度，连续传代仍能稳定表达gB蛋白，适合于疫苗的大规模生产，可用于制造疫苗。【专利说明】
本专利技术涉及应用反向遗传技术，拯救一株以新城疫病毒为载体表达传染性喉气管炎病毒gB蛋白的重组疫苗株rAI4-gB，用于研制疫苗。
技术介绍
反向遗传操作技术(Reversegenetics manipulation technique)是指将 RNA病毒基因组RNA逆转录成cDNA，在体外通过采用基因突变、基因插入、基因敲除、基因置换等方法人为构建新的具有感染性的病毒，以研究病毒的基因组结构及功能和病毒宿主之间的相互作用等，也叫全长感染性cDNA克隆技术，又常被称为“病毒拯救”。新城疫病毒反向遗传技术的建立，“拯救”出的RNA病毒来源于cDNA克隆，因此，可通过中间过程中人为加入的DNA环节，在DNA水平上对RNA病毒基因组进行各种体外人工操作，以此来构建新型病毒载体表达外源基因和进行疫苗的研发等。新城疫(Newcastle disease),又称亚洲鸡痕、伪鸡痕等。是由新城疫病毒引起的主要感染鸡、鸽 、鹌鹑、火鸡等家禽和野生禽类的一种急性、败血性、高度接触性传染病。可感染240种以上的禽类，世界各国都十分重视该病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为动物法定必报传染病。新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)是单股、不分节段的负链RNA病毒，属于副粘病毒科、副粘病毒亚科、禽腮腺炎病毒属成员。按照标准的致病性指标可以将病毒分为速发型(强毒)、中发型(中等毒力)和缓发型(弱毒)。基因组长度大约15kb，其结构为3’ -leader-NP-P-M-F-HN-L-trailer-5’，依次编码6种结构蛋白:核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein, NP)、憐蛋白(Phosphoprotein, P)、基质蛋白(Matrix protein, Μ)、融合蛋白(Fusion protein, F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(Heamagglutinin-Neuraminidase protein, HN)和大分子蛋白(Large protein, L)。其中F蛋白具有诱导细胞融合、破坏细胞的作用，是NDV毒力和致病性的主要决定因素。鸡传染性喉气管炎是由传染性喉气管炎病毒(Infectious LaryngotracheitisVirus, ILTV)引起的一种鸡的急性上呼吸道传染病，是危害养禽业的重要疫病之一，世界各地均有发生。ILTV属于疱疹病毒科α疱疹病毒亚科，其基因组为155kb的双链线性DNA分子。基因组分为长独特区(UL)、短独特区(Us)、反向重复序列(IR)和末端重复序列(TR)。gB基因位于长独特区，不同毒株之间的gB基因序列高度同源，十分保守，很少发生变异。它编码的糖蛋白复合物位于病毒粒子表面，是病毒感染所必需的主要免疫糖蛋白，也是该病毒的主要保护性抗原基因。因此，gB基因是目前ILTV研究的热点。目前，用于防制鸡传染性喉气管炎的活疫苗普遍存在着毒力偏强、易于造成潜伏感染和病毒返祖等缺点，很难从根本上控制此病，流行株在疫苗的免疫压力下，已经发生了较大的变异。因此急需研制一种安全有效的新型重组病毒疫苗来防控此病。疫苗接种是防制新城疫和传染性喉气管炎这两种疾病的主要有效手段。但灭活苗不能提供足够的保护，油乳佐剂会引起局部不良反应从而导致肉质下降以及动物的不适，另外，家禽生长过程中需要接种的疫苗种类多，且部分疫苗需要两次甚至多次的免疫接种，给家禽造成应激，对生长构成了不同程度的影响；同时疫苗接种常常会干扰疾病的血清学监测，常规疫苗的制备及其免疫接种费时费力，有散毒的危险，会酿成严重的后果。载体病毒最重要的一个特点是能被用来迅速研制出针对新发高致病性传染病的基因工程疫苗。NDV除具备这一特点外，还具有遗传稳定性好、不存在与细胞基因组整合的可能、高繁殖性能、免疫刺激性强等诸多优点，可作为疫苗载体, Journal of Virology, 2006，80 (21): 10293-10306.]。在 NDV 基因组内插入外源基因后的重组病毒，可在动物体内复制并稳定持续地表达外源蛋白，用此重组病毒作为疫苗，可以诱导机体产生针对Al和ND的双重免疫保护力.Proc Natl Acad SciU S A, 2006,103(21):8197-8202.Schroer D,Veits J, Grund C, et al.Vaccination withNewcastle disease virus vectored vaccine protects chickens against highlypathogenic H7avian influenza virus.Avian Dis,2009，53(2):190-197.]，Lamb 等研究发现副粘病毒的转录呈极性效应,越靠近3’端的基因其转录产物越多，越靠近5’端转录产物的量越低。从目前研究来看，外源基因在NP基因或P与M基因之间插入时，`其表达量较高，这两个位置成为外源基因插入的首选。因此，本研究中选取了在P与M基因之间插入传染性喉气管炎病毒的gB基因。2011年胡增磊等对本实验室分离的VIId亚型NDV毒株JS5/05的F蛋白裂解位点突变后成功构建了全长克隆载体PNDV/AI4，经反向遗传操作获得了致弱病毒AI4，其尿囊液的 HA 效价为 101og2 。2011 年，扬州大学农业部畜禽传染病重点开放实验室在安徽某蛋鸡场分离到一株传染性喉气管炎病毒Anhu1-2011-2 (GenBank:JN969089)。因此，本专利技术在上述基础上，以pNDV/AI4为骨架，构建可表达传染性喉气管炎病毒gB蛋白的重组新城疫疫苗株，用于应对当前传染性喉气管炎和新城疫的流行。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于专利技术一种以新城疫病毒为载体表达传染性喉气管炎病毒gB基因的重组疫苗株，用于制造疫苗。本专利技术表达传染性喉气管炎病毒gB基因的重组疫苗株rAI4-gB，于2013年8月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号CGMCC No:8053o 本专利技术利用已建立的新城疫病毒ΑΙ4株的反向遗传操作平台，将本实验室分离的一株传染性喉气管炎病毒流行株的gB基因中编码主要抗原蛋白的片段插入NDV全长转录载体pNDV/AI4的P、M基因之间，构建出重组质粒pNDV/AI4_gB，该重组质粒与三个辅助质粒共转染BSR-T7/5细胞后，获得了具有较高繁殖性能的表达传染性喉气管炎病毒gB基因的重组疫苗株rAI4-gB，适合疫苗的大规模生产。本专利技术的第二本文档来自技高网...
【技术保护点】
表达传染性喉气管炎病毒gB蛋白的重组新城疫疫苗株rAI4?gB，它的保藏号CGMCCNo：8053。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘秀梵，陈坚，屠颉，吴艳涛，王晓泉，胡顺林，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：
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