本发明专利技术公开了一种高效表达罗氏沼虾凝集素的酿酒酵母工程菌，属于生物技术领域。本发明专利技术通过将罗氏沼虾凝集素MrLectin的cDNA克隆至载体质粒pHAC181上，克隆成功的阳性转化子经过测序验证后，利用同源重组的方法，将目的基因整合于酿酒酵母菌株中GAL1启动子上，在半乳糖的诱导下，将目的蛋白MrLectin高效表达。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及一种高效表达罗氏沼邮凝集素的酿酒酵母工程菌，属于生物技术领 域。
技术介绍
水产养殖业是我国经济出口创汇的重要产业之一，渔业在我国已成为农业经济的 增长点。近年来甲壳类动物病害日趋严重，给我国水产养殖业带来巨大的经济损失。 甲壳类动物缺乏后天获得的特异性免疫功能，但是它们有比较完善的先天性非特 异性免疫系统，能够迅速识别和有效清除入侵的微生物。甲壳动物的凝集素化ectin)能够 促使脊椎动物的红细胞与细菌和寄生虫等病原体发生凝集作用，诱导机体产生有效的免疫 应答反应。凝集素是甲壳动物体内的一种免疫识别因子，具有类似于脊椎动物免疫球蛋白 的病原识别功能，其表面所含有特异性糖基决定簇受体，能够根据外源物表面的糖基组成 来区分异己，促进机体内吞隧细胞对异物的吞唾作用，从而诱导机体产生有效的免疫防御 应答反应。 目前，已有大量甲壳动物的凝集素Lectin基因序列已被克隆出来，但还未见有利 用酿酒酵母对罗氏沼邮凝集素Lectin基因进行真核表达及蛋白功能研究的报道。众所周 知，基因的异源表达受到宿主、载体、启动元件等多种因素的影响。因此，如何实现罗氏沼邮 凝集素Lectin基因的异源表达、活性表达、高效表达是目前亟需解决的问题。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术利用酿酒酵母实现了罗氏沼邮（Macrobrachium rosenbergii)凝集素Lectin的异源表达、活性表达、高效表达，对增强甲壳类动物对各种 主要疾病和环境变化的抵抗力、有效促进其健康生发挥了重要作用。 本专利技术的第一个目的是提供一种高效表达罗氏沼邮凝集素化Lectin(MrLectin 代表来源于罗氏沼邮的Lectin)的酿酒酵母工程菌，所述工程菌的构建方法是将罗氏沼 邮凝集素化Lectin的CDNA克隆至表达质粒PHAC181上得到测序验证正确的重组质粒 pHAClSl-MrLectin，然后设计同源重组引物，利用同源重组技术将目的基因化Lectin整合 至酿酒酵母宿主菌株的GALl启动子下游。该工程菌在半乳糖的诱导下，可高效表达目的蛋 白。 在本专利技术的一种实施方式中，所述罗氏沼邮凝集素化Lectin的CDNA的 CDS (coding sequence)区域翻译后的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。 在本专利技术的一种实施方式中，所述化Lectin的cDNA的CDS区域的核巧酸序列如 沈QIDNO. 1所示。 在本专利技术的一种实施方式中，所述表达质粒PHAC181是在商业化质粒YCplaclSl 的SphI和EcoRV位点插入3个组氨酸标签得到的，详见文献：AnalysesOftheeffectsof 民ck2pmutantsonPbs2p^-inducedtoxicityinSaccharomycescervisiaeidentifya MAP kinase docking motif，and unexpected functional inactivation due to acidic substitution ofT379, Mol Gen Genomics, 2004, 271:208 - 219. 在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主菌株为酿酒酵母GALl-ScRCHl，是将酿酒酵 母BY4741(Sc04153268_sl)菌株里的ScRCHl基因的启动子替换成GALl启动子。 在本专利技术的一种实施方式中，所述酿酒酵母工程菌是按照如下方法构建得到的： (1)W罗氏沼邮的CDNA为模板PCR扩增或者直接化学合成，得到核巧酸序列如SEQIDNO. 1 所示的化Lectin基因片段；似将化Lectin基因片段克隆到表达质粒PHAC181上，得到重 组表达质粒pHAClSl-MrLectin;(3)设计同源重组引物，对质粒pHAClSl-MrLectin进行扩 增，得到含有化Lectin基因的核巧酸片段，使用同源重组的方法，将该核巧酸片段整合至 酿酒酵母菌株中GALl启动子下游。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤（3)，还包括将菌株在YPG培养基中诱导培 养化后，提取菌株蛋白，用于做WESTERNBLOT检测，目的蛋白表达的菌株则为构建成功的 酵母工程菌。 本专利技术的第二个目的是提供一种高效表达罗氏沼邮凝集素化Lectin的方法，所 述方法是使用所述酿酒酵母工程菌为生产菌株。 所述方法是将酿酒酵母工程菌活化后，接种于YPG培养基中，在半乳糖的诱导下 培养化；所述YPG培养基含有D-半乳糖20g/l、蛋白腺20g/l、酵母提取物lOg/L。 本专利技术还要求保护所述酿酒酵母工程菌生产得到的凝集素化Lectin,W及其在水 产养殖、水产动物免疫及添加剂等方面的应用。 本专利技术的有益效果： (1)本专利技术构建的酿酒酵母工程菌，可W实现罗氏沼邮凝集素化Lectin的高效表 达、活性表达；本专利技术工程菌发酵得到的化Lectin具有活力，诱导培养化后每血发酵液可 得到0. 064mg蛋白。 (2)本专利技术的工程菌为酿酒酵母工程菌，表达真核来源的化Lectin,可W分泌经 正确折叠和加工的蛋白质；而且酿酒酵母具有在简单培养基中快速生长；本专利技术采用的宿 主菌酿酒酵母，是食品安全菌株，具有可用于食品生产等优点，可W直接添加到饲料中。 (3)本专利技术WPHAC181为载体、GALl-ScRCHl为宿主构建酿酒酵母工程菌，实现了 罗氏沼邮凝集素化Lectin的高效表达，W期增强甲壳类动物对各种主要疾病和环境变化 的抵抗力，有效促进其健康生长。目前新型饲料蛋白源与饲料添加剂的研制与开发己成为 促进现代水产养殖业健康发展的关键技术，本专利技术的酵母工程菌不仅可W更进一步对甲壳 类动物重要免疫基因的蛋白功能进行研究，也将为开发新型免疫增强型饲料添加剂提供科 学依据及新方法。【附图说明】 图1:罗氏沼邮凝集素MrLectincDNA扩增条带（990bp); 图2 :将罗氏沼邮凝集素化LectincDNA克隆至载体PHAC181上时，菌落PCR验证 阳性转化子（a图中Line21，b图中Line2, 6, 7为正确的转化子）；[002引 图3 :将罗氏沼邮凝集素MrLectin CDNA克隆至载体PHAC181上时，阳性转化子的 酶切验证化ine 10, 12, 13, 14, 15, 16为正确的转化子）； 图4 :高保真酶PrimeSTARG)(L酶对重组质粒pHAClSl-MrLectin进行扩增 巧348bp); 图5 :检测引物检测pHAClSl-MrLectin与含GALl启动子的菌株同源重组（同源 重组成功的条带为1276bp，a图中Line2,b图中Line7, 9为正确的转化子）； 图6 :肥STERNBL0T检测到Gal-pHAClSl-MrLectin蛋白表达，目的蛋白为42邸。【具体实施方式】 在本专利技术中，首先采用基因克隆技术，具体为：将罗氏沼邮RNA提取后，用反转录 试剂盒将RNA反转录为cDNA。利用高保真PCR酶将目的基因片段化Lectin进行扩增。扩 增得到的基因片段与载体PHAC181连接，转入大肠杆菌感受态细胞transTl中，涂布于LA 平板上37°C过夜培养。LA平板上得到的阳性转化子进行酶切验证及测本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高效表达罗氏沼虾凝集素Lectin的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述工程菌的构建方法是将罗氏沼虾凝集素Lectin的cDNA克隆至表达质粒pHAC181上得到测序验证正确的重组质粒pHAC181‑MrLectin，然后设计同源重组引物，利用同源重组技术将目的基因MrLectin整合至酿酒酵母宿主菌株的GAL1启动子下游。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杜婕，蒋伶活，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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