一种降解蛋白质的基因重组酿酒酵母及构建方法和应用技术

一种降解蛋白质的基因重组酿酒酵母，含有外源蛋白酶基因。本发明专利技术还公开了上述基因重组酿酒酵母的构建方法。本发明专利技术的基因重组酿酒酵母是通过对蛋白酶基因进行密码子改造，与酿酒酵母表达载体重组并转入酿酒酵母细胞，获得正确的表达构建而成。该基因重组酿酒酵母有效地提高了酵母细胞对蛋白质的降解效率，且具有生产成本低、生物量可重复利用、无二次污染等特点，对环境领域蛋白类物质的降解、工业领域蛋白酶的规模发酵与生产具有积极的推动作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，具体地公开了一种高效降解蛋白的基因重组酿酒 酵母。 本专利技术还设及上述基因重组酿酒酵母的构建方法。 本专利技术还设及上述基因重组酿酒酵母在降解蛋白质方面的应用。
技术介绍
微生物蛋白酶具有来源广、成本低等优势，在工业化生产中发挥着重要作用。丝氨 酸蛋白酶是最常见的一类蛋白酶，被广泛应用于医药、食品、酿造等行业，具有重要的研究 和应用价值。目前研究主要集中于产酶菌株的筛选、酶学性质研究和产酶基因片段的克隆 等方面，提高对环境的适应性及稳定性、扩大其应用范围是工业化生产中亟待解决的主要 问题。基因工程技术为该问题的解决及该酶的应用改造提供了平台。 酿酒酵母是工业化发酵的常见菌种，生物安全性高，其表面展示系统能够使外源 蛋白在细胞表面大量表达。细胞表面展示技术的原理是将外源肤W融合蛋白的形式固定在 细胞的外膜，被表达的多肤可W保持相对独立的空间结构和生物活性，集表达、纯化、固定 于一体，在医药、食品、生物燃料、环境保护等多个领域都有广泛的应用前景。截至目前，对 于密码子改造后的SUb基因在酿酒酵母细胞外膜表达是否可W提高酶活性，国内外尚未见 相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种降解蛋白质的基因重组酿酒酵母。 本专利技术的又一目的是提供一种上述基因重组酿酒酵母的构建方法。 为实现上述目的，本专利技术提供的降解蛋白质的基因重组酿酒酵母，含有外源蛋白 酶基因。 本专利技术提供的上述降解蛋白质的基因重组酿酒酵母的构建方法，步骤为：S1、按照酿酒酵母密码子偏爱性，改造蛋白酶基因编码序列，合成该基因；S2、将蛋白酶基因与酿酒酵母表面展示载体PYDl连接构建重组表达载体；[001引 S3、将上述构建得到的重组表达载体转化到酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae化BYlOO中，构建基因重组酿酒酵母。 本专利技术提供的的基因重组酿酒酵母可W应用于蛋白质的降解。 本专利技术的基因重组酿酒酵母有效地提高了酵母细胞对蛋白质的降解效率，且具有 生产成本低、生物量可重复利用、无二次污染等特点，对环境领域蛋白类物质的降解、工业 领域蛋白酶的规模发酵与生产具有积极的推动作用。【附图说明】 图1是表达载体pYDl质粒图谱。 图2是重组蛋白酶酿酒酵母转化子菌落PCR鉴定。【具体实施方式】 本专利技术构建了高产蛋白酶的基因工程菌，研究了其酶学特性，该工程菌可用于大 量生产高纯度蛋白酶，表达量高，成本低，应用范围广，为蛋白酶的工业化生产提供一种新 方法，为工业化大量生产该蛋白酶提供了技术参考，为油脂精深加工、生物能源等方面工业 蛋白酶源的开发提供条件。 本专利技术提供的表面展示蛋白酶的重组酿酒酵母，通过在细胞表面表达蛋白酶，增 大酶与底物的接触面积，达到提高蛋白质降解效率的目的。所述蛋白酶基因连接到载体 pYDl，并转化到酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae化BYlOO中。同时，对该酶特性进行 了分析。 本专利技术的具体方案为： 1)按照酿酒酵母密码子偏爱性，改造蛋白酶基因编码序列，合成该基因； 2)将蛋白酶基因与酿酒酵母表面展示载体PYDl连接，构建重组表达载体； 扣将上述构建得到的重组表达载体转化到酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae化BYlOO中，得到基因重组酿酒酵母。W下为本专利技术技术方案的具体描述： 质粒及基因重组酿酒酵母的构建：根据Genebank数据库中公布的蛋白酶基因编码序列，经密码子改造后，进行全 基因合成；将人工合成的蛋白酶基因克隆到质粒pYDl(购自Invitrogen生物技术有限公 司，货号：V835-01)构件表面展示表达载体；将构建好的表达载体转化酿酒酵母邸YlOO(M AT口ura3-52t巧lleu2Alhis3A200P巧 4::HIS3prblA1.6RcanlGAL(pIU211:URA3))。 PCR方法验证阳性转化子，引物序列为：SUB1-GGATCCATGACTGAAAGAAAGCA， SUB2-CTCGAGGTTAACCTTTTGAACT)〇 [002引酿酒酵母的培养：Yro培养基：用于酿酒酵母（S.cerevisiae)的生长、培养。1%酵母提取物灯east extract) ,2%膜化蛋白腺（Typtone) ,2%葡萄糖（Glucose) ,2%琼脂（Agar)(配制固体培 养基），1. 05kg/cm2、121. 3°C条件下灭菌20min。配制YPD固体培养基时，为防止葡萄糖在 高溫下发生焦化，不与琼脂一起高溫灭菌，而采用过滤除菌加入培养基中。MD基本培养基：用于酿酒酵母转化子的培养、筛选。0. 67%YNB(含硫酸锭，不含 氨基酸），2%葡萄糖（Glucose)，0.01%亮氨酸(Xeucine)，0.01%色氨酸CTrypto地an)(按 验要求添加），2%琼脂（Agar)(配制固体培养基），1. 05kg/cm2、121. 3°C条件下灭菌20min。 2 %葡萄糖过滤除菌加入培养基。 酿酒酵母的活化：使用处于4°C保存的酿酒酵母前必须首先进行活化。用接种针 挑取一个酿酒酵母单菌落，在新的Yro平板上划线，于30°C静置培养2d。 酶学特性分析： 使用YTO培养基培养重组酿酒酵母，检测不同反应抑、溫度、化Cl浓度、抑制剂 和变性剂等对外源蛋白酶活性的影响，比较最优反应条件下密码子改造对重组酶活性的影 响。 本专利技术通过基因改造，将蛋白酶基因sub转入酿酒酵母细胞，实现了该蛋白在细 胞表面的展示，获得了一株高效降解蛋白酶的基因重组酿酒酵母邸Y100-SUB。酪蛋白双 层平板检测表明在诱导4化时重组酶具有相对较大的透明圈出现，具有蛋白酶生物学活 性。该工程菌所产酶的酶学特性：最适反应溫度为55°C;最适抑值为7. 5 ;1M化Cl胁迫 下可保持80%活性，对盐具有一定的耐受性；对十二烷基硫酸钢（SD巧敏感，乙二胺四乙酸 (邸TA) >5mM时无活性，对咪挫、组氨酸（含咪挫基）具有较高抗性；与出发菌株邸YlOO相 比，密码子改造后重组酶活性提高了 20. 16%。W上特性表明该重组蛋白酶耐盐、耐高溫，对 抑制剂和变性剂具有普遍抗性，对碱性环境表现出较强的适应力，具有非常好的市场应用 前景。 W下作详细说明。 1、目的序列获得与表达载体构建 从Genbank上获得蛋白酶基因编码序列，分析酿酒酵母密码子使用规律，使用偏 爱密码子代替稀有密码子。同时，在C端和N端分别引入BamHI和化Ol两个酶切位点，获 得改造的蛋白酶基因序列：GGATCCATGACTGAAAGAAAGCAAGTTTGGTTCGAAGAAGCCAACTCTAGATTGGACCCAGGTTTGGTT GGTCAATTGATGAAGAAGAGAAAGGAAGACCCAAACGAAACTTCTGAAGACACTTTGCCAGTTATTGTTAAGGTTTA CCAAAACTGTACTAAGGACATGAAGGAAGACTTGTTGAAGACTTGTGAAGGTGACTCTTGTAACACTTTGAACGACG ACATGGAAATTTTGCACTCTTTGTACGGTGACTTGACTCCAAAGAAGATTAGAGAATTGAAGAACC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种降解蛋白质的基因重组酿酒酵母，含有外源蛋白酶基因。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：席北斗，黄彩红，何小松，高如泰，袁英，赵昕宇，党秋玲，
申请(专利权)人：中国环境科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11