一种烟曲霉生物膜流动模型制造技术

本发明专利技术公开一种烟曲霉生物膜流动模型，包括制备烟曲霉孢子悬液、建立生物膜流动模型和胞外基质染色及CLSM观察生物膜形成。将连接好的流动装置至于37℃恒温培养箱中，泵0.5%次氯酸钠的储液瓶消毒，随后高速流通无菌双蒸水清洗流动装置，灭菌清洗完毕后，连接泵入RPMI-1640培养基，将配制备好的孢子悬液以300μL/channel从chamber上游注入，夹闭两端，倒置2-4小时后开通，菌体表面流速为0.1-0.5mm/s；培养8h、16h、24h、48h、72h后，行胞外基质染色，CLSM观察生物被膜的形态。本发明专利技术烟曲霉生物膜流动模型具有无破坏性、实时观察等优点，可模拟植入导管相关感染的情况，是体外过渡到体内研究的研究模型。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物
，具体设及一种烟曲霉生物膜流动模型及流动装置。
技术介绍
烟曲霉是一种常见的条件致病性真菌，其抱子体积微小，直径2~3ym，漂浮于空 气中，经呼吸道进入人体，肺部是曲霉感染主要发生部位。当宿主免疫力低下或者肺部的防 御机制下降时，可引起过敏性支气管肺曲霉病（ABPA)、曲霉瘤或侵袭性曲霉病（IA)。而烟 曲霉感染中90 %为侵袭性感染，临床表现缺乏特异性，死亡率高。近年的研究表明烟曲霉菌 可分泌大量胞外基质，在感染病灶中形成生物被膜，加重真菌的耐药性。烟曲霉感染已经受 到众多临床工作者和科研者的关注。目前国外关于曲霉流动和静止模型下生物被膜成膜能 力仍存在争议，曲霉的研究模型尚无定论。而国内研究人员大多研究的是静止模型的生物 膜形态及结构，相关的药物干预亦是针对静止模型状态的生物膜形态和结构的研究，但静 止模型的生物膜形态和生物体内的生物膜形态是存在差异的，生物体内由于血液的流动W 及其他因素的影响，因此在静止模型下研究出的药物，具体实施到生物体内，却达不到预期 的效果。运已成为了限制烟曲霉生物膜及其相关的药物干预研究的一大难题。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决现有大多研究静止模型的烟曲霉生物结构及形态，提供一种 更加接近于生命体内烟曲霉生物膜的形态和结构的研究模型，提供一种烟曲霉生物流动模 型。为实现本专利技术目的所使用的技术方案为： 一种烟曲霉生物膜流动模型，包括制备烟曲霉抱子悬液、建立生物膜流动模型和胞外 基质染色及化SM观察生物膜形成； (1) 制备烟曲霉抱子悬液：将受试烟曲霉菌株在马铃馨葡萄糖琼脂斜面培养基上， 35-37°C下活化3-5天，用含0. 025%Tween20的PBS缓冲液冲洗斜面收集抱子，用MCPS缓 冲后调pH值为6. 9-7. 1的RPMI-1640液体培养基重悬抱子，光学显微镜下用血细胞板计数 悬液中的抱子量，用上述RPMI-1640液体培养基将计数好的抱子悬液稀释，调整抱子终浓 度为1-3X1Q5抱子/ml; (2) 建立生物膜流动模型：连接流动装置，所述的流动装置包括蠕动累，进液储液瓶， 娃橡胶管，止水夹，单向排气装置，chamber,废液收集瓶；蠕动累与进液储液瓶通过娃橡胶 管连接，与进液储液瓶的娃橡胶管即进液端，蠕动累与单向排气装置通过娃橡胶管连接，单 向排气装置和chamber通过娃橡胶管连接，距chamber两端2-4cm处的娃橡胶管上各设置 一个止水夹，chamber和废液收集瓶通过娃橡胶管，将连接好的流动装置至于35-37°C恒 溫培养箱中，累0. 5%次氯酸钢的储液瓶消毒，随后高速流通无菌双蒸水清洗流动装置，灭 菌清洗完毕后，连接累入RPMI-1640培养基，将配制备好的抱子悬液W300yL/channel从 chamber上游注入，夹闭两端，倒置2-4小时后开通，菌体表面流速为0. 1-0. 5mm/s;培养 化、1化、24h、4化、7化后，行胞外基质染色，CLSM观察生物被膜的形态； (3)胞外基质染色及化SM观察生物膜形成：无菌生理盐水缓慢清洗chamber中的生 物膜，无菌注射器注入300yL制备好的門TC-ConA染液，37 °C避光染色90分钟，累无菌 去离子水洗去多余染液，然后置于化SM下观察，激发光和滤过光的波长分别为488nm和 BF*515-530nm。 优选地，将所述的流动装置的置于35-37. 0 °C恒溫生化培养箱中，流动装置进液 端管道入口置于含有150-200ml0.5%次氯酸钢的储液瓶中，出液端娃橡胶管开口置入废 液收集瓶中，启动蠕动累，调节累速为1. 5-2.化pm，持续4-化累入0. 5%次氯酸钢消毒于 整个流动装置；随后将进液端娃橡胶管入口置入含1. 5-化灭菌双蒸水的烧瓶中，W30-50 rpm累速高速流通无菌双蒸水3-4h清洗流动装置，同时开启恒溫培养箱内的紫外射线消毒 灯消毒整个装置外表面及其恒溫培养箱内部，直至灭菌清洗完毕； 将流动装置进液端管娃橡胶管开口置入经MCPS缓冲后抑值为6. 9-7. 1的RPMI-1640 液体培养基的储液瓶中，培养液溫度为35-37°C，调节蠕动累累速为3-5巧m，持续累入 5-lOmin，使RPMI-1640液体培养基充满整个装置管道；暂时停止蠕动累，于距chamber上 游2-2. 5cm处夹闭止水夹，用75%酒精消毒该段娃橡胶管，用1血灭菌注射器将步骤（1)中 配制备好的浓度为1-3XIO5抱子/ml的抱子悬液W300yL/channel的接种量，从该段管 道注入chamber,进液完毕后退出注射针头，将chambe下游的娃橡胶管用止水夹夹闭，将 chamber倒置使其观察面朝下，静置2-4小时使抱子沉降并粘附于各chamber内各channel 的观察面；抱子粘附完成后，将chamber转置使各channel的观察面朝上，再次开启蠕动累， 调节累速为1. 75巧m，菌体表面流速为0. 2mm/s;于37. 0 °C恒溫培养化、1化、24h、4化、7化 后，停止蠕动累，对上述各个时点各个channel观察面上形成的烟曲霉生物膜进行胞外基 质染色，激光共聚焦显微镜（CLSM)观察生物被膜的形态。W上所述的流动装置还可W用75%乙醇进行消毒，消毒后，用转速为50-lOOrmp的 无菌双蒸水清洗。 优选地，所述的步骤（2)抱子悬液在chamber倒置2小时后开通。 优选地，所述的步骤（2)累流速为1.75rpm，菌体表面流速为0. 2mm/s。 优选地，所述的步骤（3)胞外基质染色及化SM观察生物膜形成：相应时间点培养 结束后，W1. 0-1. 5巧m累速缓慢累入灭菌PBS水漂洗chamber各channel内的已形成的烟 曲霉生物膜3-5min，于距chamber上游2-2. 5cm处夹闭止水夹，Iml注射器缓慢注入300JiL 制备好的門TC-ConA染液，注入完毕后夹闭chamber下游止水夹，将chamber倒置，于37°C 避光静止染色90min后，向chamber内注入无菌去离子水洗去多余染液，将其观察面朝上， 置于化SM下放大200倍观察各channel中烟曲霉生物被膜的生长情况，激发光和滤过光的 波长分别为488nm和BP515-530nm。 W上所述的烟曲霉生物膜流动模型在烟曲霉生物膜研究中的应用。 本专利技术的有益效果为：流动模型在体外生物膜研究是在蠕动累的帮助下将新鲜的 培养液队直定流速输送到微生物表面，维持稳定的抑、氧含量、液体剪切力，该模型具有无 破坏性、实时观察等优点，可模拟植入导管相关感染的情况，是体外过渡到体内研究的研究 模型。 流动模型的生物膜在发展过程中，烟曲霉粘附于载体并逐渐延长交叉缠绕成=维 立体结构，生物量、基质覆盖率、平均厚度和平均扩散距离不断增加，BF表面逐渐趋于平坦， 粗糖系数下降。而且本专利技术验证了流动和静止模型的区别对曲霉的粘附及萌芽时间并无影 响，而是对菌丝密度和ECM分泌量的影响。【附图说明】 阳01引图1流动和静止状态下烟曲霉生物膜的生长情况；其中A1-A3分别表示流动模型 化、2地、7化的生物被膜3D形态；B-B3分别表示静止模型化、2地、7化的生物被膜3D形态。【具体实本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种烟曲霉生物膜流动模型，其特征在于，包括制备烟曲霉孢子悬液、建立生物膜流动模型和胞外基质染色及CLSM观察生物膜形成；（1）制备烟曲霉孢子悬液：将受试烟曲霉菌株在马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，35‑37℃下活化3‑5天，用含0.025% Tween20的PBS缓冲液冲洗斜面收集孢子，用MOPS缓冲后调pH值为6.9‑7.1的RPMI‑1640液体培养基重悬孢子，光学显微镜下用血细胞板计数悬液中的孢子量，用上述RPMI‑1640液体培养基将计数好的孢子悬液稀释，调整孢子终浓度为1‑3×105孢子/ml；（2）建立生物膜流动模型：连接流动装置，所述的流动装置包括蠕动泵，进液储液瓶，硅橡胶管，止水夹，单向排气装置，chamber，废液收集瓶；将连接好的流动装置至于35‑37℃恒温培养箱中，泵0.5%次氯酸钠的储液瓶消毒，随后高速流通无菌双蒸水清洗流动装置，灭菌清洗完毕后，连接泵入RPMI‑1640培养基，将配制备好的孢子悬液以300μL/channel从chamber上游注入，夹闭两端，倒置2‑4小时后开通，菌体表面流速为0.1‑0.5mm/s；培养8h、16h、24h、48h、72h后，行胞外基质染色，CLSM观察生物被膜的形态；（3）胞外基质染色及CLSM观察生物膜形成：无菌生理盐水缓慢清洗chamber中的生物膜，无菌注射器注入300μL制备好的FITC‑ConA染液，37℃避光染色90分钟，泵无菌去离子水洗去多余染液，然后置于CLSM下观察，激发光和滤过光的波长分别为488nm和BP515‑530nm。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈一强，罗劲，李冰，孔晋亮，
申请(专利权)人：广西医科大学，
类型：发明
国别省市：广西;45