一种利用烟曲霉菌生产烟曲霉素的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用烟曲霉菌生产烟曲霉素(fumagillin)的方法，包括如下步骤：将所述烟曲霉菌接种于GMM固体培养基进行菌种活化，所述GMM培养基pH值为5‑7；将活化后的菌种孢子制备孢子悬液后接种于CYA固体培养基、CXMA固体培养基或LMM液体培养基，所述CYA固体培养基、所述CXMA固体培养基pH值自然，所述LMM液体培养基pH值调节为5‑7，在25℃至37℃条件下培养；收集培养的烟曲霉菌提取烟曲霉素及烟曲霉素衍生物。本发明专利技术针对影响烟曲霉生长及烟曲霉素的碳氮源以及微量元素进行了筛选，并对相应的微量元素浓度进行优化，获得了较高的烟曲霉素产量。

Method for producing Aspergillus fumigatus by Aspergillus fumigatus

The present invention relates to the production of Aspergillus fumigatus fumagillin (fumagillin) method comprises the following steps: the inoculation of Aspergillus fumigatus in GMM solid medium strain activation, the GMM pH value of medium was 5 7; the activated bacteria spore spore suspension preparation after inoculation in CYA medium, CXMA medium or LMM medium, the CYA solid medium, the CXMA solid culture medium pH value nature, the LMM liquid culture medium pH value adjusted to 5 7, cultured in 25 to 37 DEG C conditions; cultured Aspergillus fumigatus extract fumagillin and fumagillin derivatives. The invention aims at influencing the growth of Aspergillus fumigatus and the carbon and nitrogen sources and trace elements of the Aspergillus fumigatus, and optimizes the corresponding trace element concentration to obtain a high yield of Aspergillus fumigatus.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物发酵领域，具体涉及一种利用烟曲霉菌生产烟曲霉素(fumagillin)的方法。
技术介绍
烟曲霉菌(Aspergillusfumigatus)是一种重要的真菌，在自然界广泛分布，存在于土壤和动物腐烂的毛皮。烟曲霉是条件致病菌和重要的病原，产生的分生孢子在空气中，通过人的呼吸道进入人体，导致免疫功能低下或菌群失调等特殊状态患者感染。另一方面，饲料中烟曲霉产生的如胶霉毒素(gliotoxin)、烟曲霉素(fumagillin)等多种真菌毒素严重伤害动物的健康并降低生产能力，威胁着人类的食品安全和健康。近年来，烟曲霉全基因组测序的完成为烟曲霉来源的真菌毒素研究提供了有力的工具。研究发现，烟曲霉素也可以作为药物用于人类疾病的治疗和农业生产中的生物防治。烟曲霉素可作为一种血管生成抑制剂(angiogenesis)，具有较强抗肿瘤血管生成作用。血管新生与肿瘤生长密切相关，对于肿瘤生长、浸润和转移具有重要意义，阻止肿瘤血管的形成也就可能抑制肿瘤的生长。人们已研究和开发了能破坏和抑制血管生成、有效地阻止肿瘤生长和转移的药物，其中烟曲霉素可特异性抑制血管内皮细胞的增殖，其作用靶标为甲硫氨酸氨基肽酶2(MetAP-2)。研究发现，烟曲霉素可完全抑制碱性成纤维细胞生长因子存在状态下的血管内皮细胞的生长和小鼠肿瘤血管生成，但具有引起体重减轻等明显的毒副作用。烟曲霉素碱水解产生烟曲霉醇及在此基础上人工合成的衍生物可作为一种血管抑制剂可起到抗肿瘤血管生成，对肝纤维化和肝癌、口腔鳞状上皮细胞癌、内皮细胞增殖和迁移、结肠癌裸鼠腹水瘤LOVO细胞生长、骨肉瘤(osteosarcoma)等起到抑制作用。合成的烟曲霉素衍生物(TNP-470,PPI-2458,CKD-732)已用于治疗人类癌症的临床试验，通过以甲硫氨酸胺基肽酶2为作用靶标破坏肿瘤血管；TNP-410用于治疗前列腺癌(prostatecancer)、非小细胞肺癌(NSCLC)和黑素瘤(melanoma)等癌症。烟曲霉素的神经毒性在一定程度上限制了其在临床诊断上的应用，而新发现的烟曲霉素衍生物PPI-2458和CKD-732表现出了较轻的神经毒性。烟曲霉素及其衍生物TNP-470和CKD-732能减少食物吸收、体重、脂肪量和脂肪细胞的大小，从而作为治疗肥胖症的潜在药物。烟曲霉素还可以有效抑制阿米巴病(amebiasis)和其他原生动物寄生感染，并可作为治疗风湿性关节炎和肥胖症等多种疾病的潜在药物。烟曲霉素可用于抗微孢子虫感染，特别是在养蜂业中具有防治蜜蜂微孢子虫病的作用，也用于鱼类微孢子虫感染治疗。蜜蜂孢子虫病在世界各养蜂发达国家都有发生，是由蜜蜂孢子虫寄生在蜜蜂肠上皮细胞所引起的一种蜜蜂成虫寄生虫病。微孢子虫破坏中肠肠壁，为其他微生物的入侵开辟了道路，微孢子虫病长伴随着马氏管变形虫病、慢性麻痹病、黑蜂王病毒、螺旋体病以及白垩病等，形成所谓的“爬蜂病”混合感染。工蜂、母蜂和雄蜂都能感染蜜蜂孢子虫病，引起机体功能衰弱，采蜜能力降低，寿命缩短。蜜蜂微孢子虫病可能迁延几年才使整个蜂群死亡。烟曲霉素是可成功应用于防治蜜蜂微孢子虫病，它虽不杀死微孢子虫孢子，但能大大减少蜜蜂微孢子的产生，降低蜂群中蜜蜂总的感染率，从而减少蜂群的损失，增加了蜜蜂及幼虫的数量，使蜂蜜获得增产。关于烟曲霉菌产生次级代谢产物烟曲霉素及其衍生物的优化培养方法，仅有很少的报道(WenYang,CarbonandnitrogensourcenutritionoffumagillinbiosynthesisbyAspergillusfumigatus,CurrentMicrobiology,2003,275–279)，但该报道中的烟曲霉素其产量低，很难用于工业化生产或应用。
技术实现思路
本专利技术提供了一种利用烟曲霉菌生产烟曲霉素(fumagillin)的方法，针对影响烟曲霉生长及烟曲霉素的碳氮源以及微量元素进行了筛选，并对相应的微量元素浓度进行优化，获得了较高的烟曲霉素产量。本专利技术提供一种利用烟曲霉菌生产烟曲霉素的方法，其特征在于，包括如下步骤：将所述烟曲霉菌接种于GMM固体培养基进行菌种活化，所述GMM培养基pH值为6.5；将活化后的菌种孢子制备孢子悬液后接种于CYA固体培养基、CXMA固体培养基或LMM液体培养基，所述CYA固体培养基、所述CXMA固体培养基pH值自然，所述LMM液体培养基pH值调节为5-7，在25℃至37℃条件下培养；收集培养的烟曲霉菌及培养基提取烟曲霉素及烟曲霉素衍生物。在上述技术方案中，所述GMM固体培养基每升包括：葡萄糖10g，硝酸盐母液50mL，微量元素母液1mL，酵母抽提物1g，琼脂15-20g，余量为蒸馏水。在上述技术方案中，所述CYA固体培养基每升包括：NaNO32-5g，K2HPO4·3H2O0.5-2g，MgSO4·7H2O0.3-1g，KCl0.3-1g，FeSO4·7H2O0.01-0.03g，蔗糖20.0-40.0g，酵母抽提物3-8g，琼脂15-20g，余量为蒸馏水。在上述技术方案中，所述CXMA固体培养基每升包括：MgSO4·7H2O0.3-0.5g，KCl0.3-0.8g，FeSO4·7H2O0.01-0.02g，木聚糖20-40g，甘露糖30-80g，谷氨酸5-12g，琼脂15-20g，余量为蒸馏水。在上述技术方案中，所述LMM液体培养基每升包括：葡萄糖10g，酵母抽提物10g，微量元素母液1mL，硝酸盐母液50mL，余量为蒸馏水。在上述技术方案中，所述硝酸盐母液每升包括：NaNO3120g，KCl10.4g，MgSO4·7H2O10.4g，K2HPO4·3H2O30.4g，余量为蒸馏水。在上述技术方案中，所述微量元素母液每100mL包括ZnSO4·7H2O2.2g，H3BO31.1g，MnCl2·4H2O0.5g，FeSO4·7H2O0.16g，CoCl2·5H2O0.16g，CuSO4·5H2O0.16g，(NH4)6Mo7O24·4H2O0.11g，Na2EDTA5.0g，余量为蒸馏水。在上述技术方案中，所述烟曲霉菌为Aspergillusfumigatusaf293(可通过商业途径购买得到)。在上述技术方案中，所述烟曲霉素的结构式如式1所示。在上述技术方案中，所述烟曲霉素衍生物包括fumagiringillin，所述fumagiringillin的结构式如式2所示，还包括RK-95113，所述RK-95113的结构式如式3所示。本专利技术利用烟曲霉菌生产烟曲霉素的方法通过选择合适的培养基配方及培养条件，大大提高了烟曲霉素的产量并获得了部分烟曲霉素衍生物，为烟曲霉素的工业化生产及应用奠定了基础，也为烟曲霉素及其衍生物在制备新生血管抑制剂、新生血管抑制剂前体化合物、抗肿瘤药物或其前体化合物、治疗阿米巴病和其他原生动物寄生感染的药物或制备治疗风湿性关节炎和肥胖症的药物方面的应用提供了前提条件。附图说明图1为烟曲霉素的HPLC分析检测图。具体实施方式以下结合附图和实施例，对本专利技术的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本专利技术的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用烟曲霉菌生产烟曲霉素的方法，其特征在于，包括如下步骤：将所述烟曲霉菌接种于GMM固体培养基进行菌种活化，调节所述GMM培养基pH值为5‑7；将活化后的菌种孢子制备孢子悬液后接种于CYA固体培养基、CXMA固体培养基或LMM液体培养基，所述CYA固体培养基、所述CXMA固体培养基pH值自然，所述LMM液体培养基pH值调节为5‑7，在25℃至37℃条件下培养；收集培养的烟曲霉菌及其培养基提取烟曲霉素及烟曲霉素衍生物。

【技术特征摘要】
1.一种利用烟曲霉菌生产烟曲霉素的方法，其特征在于，包括如下步骤：将所述烟曲霉菌接种于GMM固体培养基进行菌种活化，调节所述GMM培养基pH值为5-7；将活化后的菌种孢子制备孢子悬液后接种于CYA固体培养基、CXMA固体培养基或LMM液体培养基，所述CYA固体培养基、所述CXMA固体培养基pH值自然，所述LMM液体培养基pH值调节为5-7，在25℃至37℃条件下培养；收集培养的烟曲霉菌及其培养基提取烟曲霉素及烟曲霉素衍生物。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述GMM固体培养基每升包括：葡萄糖10g，硝酸盐母液50mL，微量元素母液1mL，酵母抽提物1g，琼脂15-20g，余量为蒸馏水。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CYA固体培养基每升包括：NaNO32-5g，K2HPO4·3H2O0.5-2g，MgSO4·7H2O0.3-1g，KCl0.3-1g，FeSO4·7H2O0.01-0.03g，蔗糖20.0-40.0g，酵母抽提物3-8g，琼脂15-20g，余量为蒸馏水。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CXMA固体培养基每升包括：MgSO4·7H2O0.3-0.5g，KCl0.3-0.8g，FeSO4·7H2O0.01-0.02g，木聚糖20-40g，甘露糖30-80g，谷氨酸5-12g，琼脂15-20g，余量为蒸馏水。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹文兵，李伟，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11