本发明专利技术公开了一种使用吸水链霉菌发酵制备子囊霉素的方法，针对子囊霉素现有工艺在发酵罐和发酵瓶上的代谢差异，提供一种发酵罐补料工艺，即在发酵中期开始补入各类酸或各类碳源以控制发酵液pH，使发酵罐代谢情况与发酵瓶接近，从而提高了发酵单位，降低了生产成本。本发明专利技术的操作简单，条件温和，原材料来源广泛价格便宜，设备要求低，适合工业化生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物发酵
，涉及一种发酵制备子囊霉素的方法。
技术介绍
子囊霉素(Ascomycin，又名FK-520、FR-900520)是二十世纪六十年代从吸水链霉菌Streptomyceshygroscopicus的培养液中分离而得的一种大环内酯类抗生素。FK-520的化学名为17α-乙基-1β，14α-二羟基-12β[2-(4α-羟基-3β-甲氧基-1β-1-(E)-甲基乙烯基)]-23α，25β-二甲氧基-13α，19，21α，27β-四甲基-11，28-二氧杂-4-氮杂三环[22，3，1，0]二十八碳-18-2，3，10，16-四酮，一水合物。分子量为810.5，分子式为C43H69NO12H2O。FK-520结构式如下所示：子囊霉素是他克莫司(tacrolimus，FK-506)的乙基类似物。子囊霉素与他克莫司药理作用相似，也具有免疫抑制作用，主要通过与巨内酯胺基团与细胞质中特定受体macrophilin-12相结合，结合产生的亲免素复合体与细胞质内的钙调神经磷酸酶结合，抑制钙调磷蛋白磷酸酶的活性，从而阻止了能激活T细胞质内核因子(NF-AT)组分的脱磷酸作用，进而阻止T细胞合成相关炎性细胞因子的合成，其它炎性细胞因子如IL-5、IL-10和TFY-γ等的量也都相应下降。子囊霉素可用于治疗自身免疫性疾病、皮肤疾病及预防器官移植排斥。此外，一系列研究表明子囊霉素还具有抗疟疾、神经保护与再生、抗痉挛等活性。近年来国内外主要选用以吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)为代表的微生物来生产子囊霉素。1962年，日本藤泽制药公司(Fujisawa)首次从日本三宫市土壤中分离的吸水链霉菌StreptomyceshygroscopicusNo.KK317的发酵液中提取得到子囊霉素。目前我国关于子囊霉素的研究较少，发酵水平与国外还有较大差距，成本也比较高，这极大限制其使用。因此优化子囊霉素发酵工艺，提高发酵水平、降低生产成本具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术技术人员所在公司所采用的子囊霉素生产工艺，是以吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)为子囊霉素生产菌种，但在生产过程中发现，发酵罐单位显著低于发酵瓶单位，导致菌种的高产性能无法在大生产上得到体现。经过研发人员反复试验，通过比较发酵罐与发酵瓶的代谢差异，发现发酵前期两者的代谢情况基本吻合，但在发酵中后期发酵罐单位增长速度明显低于发酵瓶，同时发现发酵罐料液pH明显高于发酵瓶，因此推测由于pH的改变，高pH不利于吸水链霉菌的发酵，因此导致发酵罐单位增长速度降低，无法适应大生产的需要。针对以上问题，本专利技术技术人员开发了一种发酵罐补料工艺，即在发酵中期控制发酵液pH，使发酵罐代谢情况与发酵瓶接近，从而提高了发酵单位，降低了生产成本。本专利技术所述的发酵中期是指发酵开始后60-110h。优选地，在发酵60h后，发酵液pH停止下降时开始。本专利技术所述的pH控制范围5.0-5.8。优选地，pH控制在5.4-5.6，更优选地，pH控制在5.5。本专利技术所述控制发酵液pH的方法包括加入各类酸和/或各类碳源。本专利技术一种发酵制备子囊霉素的方法，是在发酵中期开始补入各类酸以控制发酵液pH。所述的各类酸包括但不限于硫酸、盐酸、磷酸、草酸和柠檬酸。优选地，使用硫酸。所述的补入方式为流加。所述的pH控制方式一直维持到发酵结束。该技术方案优选的发酵实施过程是，在发酵罐中培养子囊霉素生产菌，控制发酵罐的温度为27-29℃，压力为0.03-0.06Mpa，通气为0.5-1.5VVM，转速为100-600rpm，设发酵罐初始溶氧为100%，培养过程中保持溶氧30%以上。培养60h后，发酵液pH逐步停止下降，开始流加硫酸，控制料液pH在5.0-5.8，优选地，pH控制在5.4-5.6，更优选地，pH控制在5.5左右，一直维持到发酵结束。发酵7天后，单位增长缓慢，结束发酵。本专利技术另一种发酵制备子囊霉素的方法，是在发酵中期开始补入各类碳源以控制发酵液pH。所述的各类碳源包括麦芽糊精、麦芽糖、葡萄糖和甘油。优选地，使用麦芽糊精。所述的补入方式为流加，当发酵液pH下降到控制范围，停止补料，当pH回升，恢复补料。优选地，补料速度按每天补发酵液体积的0.5-1.5%设定，更优选地，补料速度按每天补发酵液体积的0.8-1.2%设定，最优选地为1.0%。所述的pH控制方式一直维持到发酵结束。本技术方案优选的发酵实施过程是，在发酵罐中培养子囊霉素生产菌，控制发酵罐的温度为27-29℃，压力为0.03-0.06Mpa，通气为0.5-1.5VVM，转速为100-600rpm，设发酵罐初始溶氧为100%，培养过程中保持溶氧30%以上。培养60h后，发酵液pH逐步停止下降，开始流加麦芽糊精，补料速度按每天补发酵液体积的0.8-1.2%设定，当发酵液pH下降到5.4-5.6，停止补料，当pH回升，恢复补料，这种控制一直维持到发酵结束。发酵8天后，单位增长缓慢，结束发酵。利用发酵瓶生产子囊霉素，发酵瓶7天单位可达1300mg/L，发酵中后期单位增长稳定，料液pH一直维持在5.5左右。而不控制pH的发酵罐，7天单位只有1000mg/L，且中后期单位增长速度明显低于发酵瓶，同时料液pH一直维持在6.0左右，明显高于发酵瓶。而使用本专利技术的发酵方法，通过控制发酵罐内发酵液的pH，可显著提高发酵单位，基本可达到与发酵瓶一致。通过提高发酵单位，就可降低大生产成本。本专利技术的操作简单，条件温和，原材料来源广泛，设备要求低，生产成本低，适合工业化生产。具体实施例下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不意味着对本专利技术有任何限制。以下为具体实施例中种子瓶、发酵瓶、发酵罐以及补料所用各类碳源和各类酸的配置方法。以下为具体实施例中摇瓶种子的培养方法：将低温保存的子囊霉素生产菌种接种到准备好的种子瓶中，在温度28℃、转速250rpm下摇瓶培养40-50h，即可得到成熟的摇瓶种子。种子培养基：麦芽糊精20g/L，葡萄糖10g/L，黄豆粉20g/L，酵母粉5g/L，酵母提取物1g/L，氯化钠2g/L，pH7.0。发酵培养基：麦芽糊精50g/L，麦芽糖25g/L，葡萄糖10g/L，甘油20g/L，黄豆粉25g/L，酵母粉10g/L，氯化钠2g/L，碳酸钙1g/L，pH7.0。750ml三角瓶装100ml种子培养基，120℃灭菌30min待用。750ml三角瓶装100ml发酵培养基，120℃灭菌30min待用。50L发酵罐配置35L发酵培养基，120℃灭菌30min待用。补料瓶中配置质量体积比30%麦芽糊精，120℃灭菌30min待用。补料瓶中配置质量体积比30%甘油，120℃灭菌30min待用。补料瓶中配置质量体积比10%硫酸，120℃灭菌30min待用。补料瓶中配置本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种使用吸水链霉菌发酵制备子囊霉素的方法，其特征在于，在发酵中期控制发酵液的pH，直至发酵结束。
【技术特征摘要】
1.一种使用吸水链霉菌发酵制备子囊霉素的方法，其特征在于，在发酵中期控制发酵液的pH，直至发酵结束。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述pH为5.0-5.8，优选pH为5.4-5.6，更优选pH为5.5。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述发酵中期为开始发酵后60-110h。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述发酵中期为开始发酵60h，发酵液pH停止下降。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于控制pH的方法为，在发酵液中加入酸，优选硫酸、柠檬酸、盐酸、磷酸、草酸，更优选硫酸。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于控制pH的方法为，在发酵液中加入碳源，优选麦芽糊精、甘油、麦芽糖、葡萄糖，更优选麦芽糊精。
7.如权利要求1-6所述的方法，其特征在于该方法为：在发酵开始后60h，发酵液pH停止下降时，加入酸和/或碳源，使得发酵液pH为5.0-5.8，优选pH为5.4-5.6，更优选pH为5.5。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于该方法为：在发酵罐中培养吸水链霉菌，控制发酵罐的温度为27-2...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘会明，郭明，刘省伟，唐恒，袁建栋，
申请(专利权)人：重庆乾泰生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆;50
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