一种发酵生产卷曲霉素的方法技术

本发明专利技术属于发酵工程领域，具体涉及一种发酵生产卷曲霉素的方法。该方法通过优化培养基和发酵条件，保证了批次间发酵单位的稳定性；通过在发酵过程中添加前体物质，可显著促进卷曲霉素生成；通过在卷曲霉素合成期间添加超顺磁性微球吸附发酵液中卷曲霉素，降低发酵产物对产生菌的反馈抑制。发酵结束后，卷曲霉素的发酵单位达到14149ug/ml，与优化前方法相比，卷曲霉素产量增加73%，提高了产能，降低了能耗及废弃物的排放。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于发酵工程领域，具体涉及一种发酵生产卷曲霉素的方法。
技术介绍
结核病死灰复燃，正严重威胁人类健康。近年来，耐多药结核（MDR-TB）的出现，以及结核分枝杆菌与人类免疫缺陷病毒的联合感染导致结核病再度在全球成流行趋势。卷曲霉素是治疗耐多药结核分枝杆菌和持留菌感染的一类重要药物。该药对耐药型结核杆菌感染引起的肺结核疗效显著，毒副作用较其他二线药物小，是目前较理想的抗结核菌药物。卷曲霉素，是由卷曲链霉菌发酵产生的环状多肽类抗生素，由四个结构相似的活性化合物IA、IB、IIA、IIB组成，其中IA和IB的含量占90%以上，是发挥疗效的主要成分。IA的分子式为C25H44N14O8，分子量为668，IB的分子式为C25H44N14O7，分子量为652。在卷曲霉素发酵过程中加入前体物质是提高发酵单位的重要手段，通过补加前体物质，可以达到控制卷曲链霉菌的生物合成方向及增加卷曲霉素产量的目的。卷曲霉素是环状多肽类抗生素，遵循NRPS（非核糖体肽合成酶）生物合成途径，其前体物质为特定的氨基酸。在卷曲霉素的生物合成途径中，主要包括非蛋白氨基酸的合成、肽环骨架的生物合成、成环后结构修饰。卷曲霉素的肽环骨架是由多个经过修饰的非蛋白氨基酸和天然氨基酸经非核糖体多肽合成酶催化合成的5肽环。成环后氨基酸残基4位上的β氨基甲酰化，氨基酸残基3位上的β赖氨酸酰基化成为重要结构修饰步骤，在氨基酸活化酶和肽缩合酶的作用下，形成副组分中间体卷曲霉素IIA、IIB向有效组分IA、IB的转化。从外界补加合成卷曲霉素的氨基酸前体物质，能明显地提高卷曲霉素的发酵水平。但是，外源性前体物质在发酵液中的残留浓度过高，会使生产菌株中毒，不利于卷曲霉素的生物合成；而前体物质不足也会大大影响卷曲霉素的生产。因此，研究适当的前体添加策略对卷曲霉素的高产稳产具有重要的意义。卷曲霉素为微生物发酵的次级代谢产物，存在于发酵液中，卷曲霉素不仅对其他生物有杀死或抑制作用，对产生菌自身也有杀死或抑制作用，即抗生素对产生菌自身存在着毒害作用。随着卷曲霉素在发酵液中浓度不断增高，其产生菌受到高浓度产物的反馈调节作用，使产生菌生物细胞及酶的潜力不能充分发挥，造成卷曲霉素的产率难以提高，从而成为制约提高卷曲霉素发酵水平的瓶颈。选育能耐受高浓度卷曲霉素的产生菌固然可以使生产指标得以提高，但并不能从根本上解决问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决现有技术中微生物发酵制备卷曲霉素存在的发酵水平低的问题，提供一种通过优化发酵培养基配方、发酵条件，在发酵过程中添加前体物质，促进卷曲霉素的生物合成，从而提高卷曲霉素产量的方法。本专利技术所提供的一种发酵生产卷曲霉素的方法，包括以下步骤：a、制备卷曲链霉菌菌株的种子液将卷曲链霉菌菌株的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基，26-30℃、培养48-72h获得种子液。其中所述的种子培养基按以下方法制得：蔗糖20.0-40.0克、酵母粉5.0-10.0克、硫酸铵2.0-3.0克、玉米浆2.0-8.0克、氯化钠0.5-2.0克、碳酸钙3.0-6.0克，加水定容至1000mL，pH6.5-7.0，121℃灭菌30min。本专利技术所述卷曲霉素产生菌可选用菌种编号NRRL2773的菌种。b、制备卷曲链霉菌菌株的发酵液将上述种子液以体积百分比7-10%的接种量接种于发酵培养基，在发酵罐中发酵，发酵24-56小时之间加入前体物质赖氨酸；总发酵时间120-144时间，培养温度27-29℃，得到发酵液。其中所述发酵培养基按以下方法制得：玉米淀粉20.0-30.0克、棉籽蛋白粉0-20.0克、黄豆饼粉0-20.0克、酵母粉0-5.0克、硫酸铵2.0-4.0克、玉米浆4.0-8.0克、磷酸二氢钾2.0-4.0克、氯化钠1.0-2.0克、碳酸钙4.0-6.0克，加水定容至1000mL，pH6.5-7.0，121℃灭菌30min。本专利技术的进一步改进在于：所述步骤b中前体物质添加量为每升发酵液加入0.5-2g。本专利技术的进一步改进在于：所述步骤b中发酵罐压为0.05±0.01Mpa、通气比为1:0.8-1.2vvm、搅拌速度为300-400rpm。本专利技术的进一步改进在于：所述步骤b中发酵48-72小时之间加入经过灭菌后的超顺磁性微球。本专利技术的进一步改进在于：所述超顺磁性微球粒径为5-30um，粒径分布为单分散，表面的功能基团为羧酸基团，超顺磁性微球为经过经氢氧化钠溶液处理后的钠型结构。本专利技术的进一步改进在于：超顺磁性微球添加量为每升发酵液加入10-20g。所述超顺磁性微球在使用前用2-5倍（v/w）的2moL/L的NaOH水溶液，静态浸泡2-4小时后过滤，然后用去离子水洗涤至pH值至为7-8，置于密闭容器内，120℃，压力为97kPa下，灭菌30min。发酵完成后，超顺磁性微球经外加磁场回收后用酸性水溶液洗脱吸附的卷曲霉素。由于采用了上述技术方案，本专利技术取得的技术进步是：采用卷曲链霉菌菌株为出发菌株，在微生物发酵生产两性霉素B的过程中，优化初始pH值、发酵温度及时间、接种量、培养基等条件，在卷曲霉素产物合成期，添加适量的前体物质，在促进有效合成卷曲霉素的同时又避免了菌株中毒。还通过添加超顺磁性微球，降低产物对产生菌的反馈抑制，从而显著提高了卷曲霉素产量。本专利技术的有益效果:上述优选条件，所获得卷曲霉素的产量从8166ug/ml提高到14149ug/ml，为卷曲霉素的工业化生产提供了一种方法。本专利技术中通过优化配方和发酵条件，保证了批次间发酵单位的稳定性；加入前体物质后可显著促进卷曲霉素的生物合成，与不添加前体物质相比，发酵单位提高20%以上；添加超顺磁性微球后可吸附发酵液中的卷曲霉素，降低发酵产物对产生菌的反馈抑制，与不添加超顺磁性微球相比，卷曲霉素产量提高24%；综合优化后，发酵单位提高73%，提高了产能，降低了能耗及废弃物的排放。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。下述实施例中所用的实验材料剂如无特殊说明均为工业级原料；试剂购自北京化工厂，超顺磁性微球由苏州纳微生物科技有限公司提供。实施例1、5L自动发酵罐发酵制备卷曲霉素卷曲链霉菌菌株的种子液将卷曲链霉菌菌株的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基，26℃、220rpm、培养72h获得种子液；其中所述的种子培养基按以下方法制得：蔗糖20.0克、酵母粉10.0克、硫酸铵2.0克、玉米浆2.0克、氯化钠0.5克、碳本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种发酵生产卷曲霉素的方法，其特征在于：包括以下步骤：a、制备卷曲链霉菌菌株的种子液将卷曲链霉菌菌株的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基，26‑30℃、培养48‑72 h获得种子液；其中所述的种子培养基按以下方法制得：蔗糖20.0‑40.0克、酵母粉5.0‑10.0克、硫酸铵2.0‑3.0克、玉米浆2.0‑8.0克、氯化钠0.5‑2.0克、碳酸钙3.0‑6.0克，加水定容至1000mL，pH6.5‑7.0，121℃灭菌30min；b、制备卷曲链霉菌菌株的发酵液将上述种子液以体积百分比7‑10%的接种量接种于发酵培养基，在摇瓶或发酵罐中发酵，发酵24‑56小时之间加入前体物质赖氨酸；总发酵时间120‑144 小时，培养温度27‑29 ℃，得到发酵液；其中所述发酵培养基按以下方法制得：玉米淀粉20.0‑30.0克、棉籽蛋白粉0‑20.0克、黄豆饼粉0‑20.0克、酵母粉0‑5.0克、硫酸铵2.0‑4.0克、玉米浆4.0‑8.0克、磷酸二氢钾2.0‑4.0克、氯化钠1.0‑2.0克、碳酸钙4.0‑6.0克，加水定容至1000mL，pH6.5‑7.0，121℃灭菌30min。

【技术特征摘要】
1.一种发酵生产卷曲霉素的方法，其特征在于：包括以下步骤：
a、制备卷曲链霉菌菌株的种子液
将卷曲链霉菌菌株的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基，26-30℃、培养48-72h
获得种子液；
其中所述的种子培养基按以下方法制得：蔗糖20.0-40.0克、酵母粉5.0-10.0克、硫酸
铵2.0-3.0克、玉米浆2.0-8.0克、氯化钠0.5-2.0克、碳酸钙3.0-6.0克，加水定容至1000mL，
pH6.5-7.0，121℃灭菌30min；
b、制备卷曲链霉菌菌株的发酵液
将上述种子液以体积百分比7-10%的接种量接种于发酵培养基，在摇瓶或发酵罐中发
酵，发酵24-56小时之间加入前体物质赖氨酸；总发酵时间120-144小时，培养温度27-29
℃，得到发酵液；
其中所述发酵培养基按以下方法制得：玉米淀粉20.0-30.0克、棉籽蛋白粉0-20.0克、
黄豆饼粉0-20...

【专利技术属性】
技术研发人员：高任龙，王耀耀，张雪霞，任风芝，耿文飞，路新华，段宝玲，杨海静，
申请(专利权)人：华北制药集团新药研究开发有限责任公司，
类型：发明
国别省市：河北;13