一种发酵法生产A40926的方法技术

本发明专利技术属于工业微生物技术领域，具体涉及了一种A40926的发酵工艺。该工艺选择在发酵中后期60～80h，CER、OUR、Kla同步下降时，流加补入无菌水和一定浓度的葡萄糖溶液，从而减轻发酵后期由于营养匮乏及溶氧受限等不利因素，在效价稳定提高的同时，降低了A40926生产。该技术成熟，适合于工业规模生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于工业微生物
，具体涉及一种A40926的发酵工艺，特别是涉及一种基于代谢参数OUR和CER补水、补糖发酵生产A40926的方法。
技术介绍
随着抗生素的广泛应用，细菌耐药性问题日益严重，尤其是耐药革兰氏阳性菌(G+)的感染已成为临床抗感染治疗失败的主要原因之一。随着耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)及耐万古霉素肠球菌(VRE)菌株的增加、替考拉宁与万古霉素存在部分交叉耐药以及一些肠球菌具有中度或高度传递性耐药性等情况的发现，寻找新的糖肽类抗生素已成为临床治疗迫切的需要(Jovetic,S.,etal.,β-Lactamandglycopeptideantibiotics:firstandlastlineofdefense？TrendsinBiotechnology,2010.28(12):p.596-603.)。达巴万星(Dalbavancin)是一种具有抗多重耐药菌的新型半合成糖肽类抗生素，与万古霉素及替考拉宁相比，具有更广谱、更强的抗菌活性和更优良的药动学性质(Billeter,M.,etal.,Dalbavancin:Anovelonce-weeklylipoglycopeptideantibiotic.ClinicalInfectiousDiseases,2008.46(4):p.577-583；Colabella,J.andL.Chagan,Dalbavancin(zeven),anovelglycopeptideforresistantgram-positiveorganisms.P&T:apeer-reviewedjournalforformularymanagement,2008.33(1):p.42-57；王靖雯,吴寅,and文爱东,新型糖肽类抗生素——达巴万星.中国感染控制杂志,2011.10(2):p.156-157.)。2014年5月，FDA批准达巴万星(DalvanceTM，DurataTherapeutics公司)用于治疗成人皮肤及软组织感染，成为第一个FDA批准的一周一次、给药两周的静脉注射抗生素，为临床治疗革兰氏阳性菌感染提供了新的选择。汤森路透预计未来几年内该药物市场销售额将呈直线上升趋势，2019年销售额将达到4.5亿美元。达巴万星合成的关键中间体A40926是由野野村放线菌(Nonomuraeasp.)ATCC39727发酵产生的天然糖肽类抗生素，其主要由结构相近的PA、PB、A、B0和B1五种成分组成，其中B0是其主要成分，这五种成分具有相同的母核结构(沈晓放，陈少欣,半合成糖肽类抗生素达巴万星前体A40926的生物合成.中国医药工业杂志,2010.41(2):p.141-147.)。目前，关于A40926发酵工艺研究和报道较少。产品主要由意大利的VicuronPharmaceuticals制药公司通过发酵生产，其报道的最高发酵单位为128mg/L。BeltramettiF.等人(ValineinfluencesproductionandcomplexcompositionofglycopeptideantibioticA40926infermentationsofNonomuraeasp.ATCC39727，TheJournalofAntibiotics，2004，57(1)：33～44)研究发现L-缬氨酸是A40926B0组份的分支酰基链的潜在前体，在T/2培养基中添加0.3％L-缬氨酸，在摇瓶实验中获得了最高220U/mL总产量，但报道仅限于摇瓶产量。较优的发酵工艺是获得高产量达巴万星前体的关键因素之一，中国专利技术专利申请CN103060405A公开了一种A40926的发酵工艺，该技术方案报道通过流加补料培养基可达到720mg/L的总产量。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服了现有技术中A40926的发酵工艺的发酵产率低，无法达到生产化要求的缺陷，提供了一种操作简单、成本低、能够大规模生产A40926的方法，具体涉及一种发酵法生产A40926的方法。本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种发酵法生产A40926的方法，将经斜面培养和种子培养所得种子液接种至装有培养基的发酵罐，发酵过程实时监测OUR(摄氧率)、CER(二氧化碳生成率)和Kla(体积氧传递系数)，发酵中后期60～80h，当CER、OUR、Kla同步下降时，开始流加补水和糖溶液；发酵进行96-144h放罐。发酵中后期60～80h，CER、OUR、Kla同步下降，一是由于菌丝量大并结团，中间的菌丝利用的溶氧受限，致使大量的中间菌丝生长受限；二是由于碳源和氮源供应不足，导致菌丝生长受限。此时，提高碳源和氮源的补给速率并往发酵罐中补水，补水的作用有两个，一是稀释菌浓，维持菌浓在合理范围内；二是增加氧传递能力，从而使OUR、CER上升。所述的发酵法生产A40926的方法，种子培养基按重量百分比计，包含以下组分：葡萄糖2％，燕麦粉2％，胰蛋白胨0.3％，FeSO4·7H2O0.001％，MnCl·4H2O0.001％，ZnSO4·7H2O0.001％，pH7.2。所述的发酵法生产A40926的方法，发酵培养基按重量百分比计，包含以下组分：玉米淀粉4％，糊精1.5％，葡萄糖2％，豆油1％，黄豆饼粉4％，胰蛋白胨1.5％，L-缬氨酸0.2％，碳酸钙0.5％，pH6.5。所述的发酵法生产A40926的方法，所述流加糖为单糖，优选葡萄糖。所述的发酵法生产A40926的方法，水为无菌水。所述的发酵法生产A40926的方法，其特征在于补料流加糖溶液的浓度为5～15％(w/v)，流速为1～3g/L·h。所述的发酵法生产A40926的方法，包含以下步骤：a)摇瓶培养：将斜面平板保存生产菌株接种入摇瓶种子培养基，在28℃培养72h，摇床转速200rpm；b)种子培养：将摇瓶种子液接种于种子罐，种子罐培养基同摇瓶种子培养基，培养温度28℃，搅拌转速180rpm，罐压0.05Mpa，通气比1:1V/V/min；c)发酵培养：种子培养72h后，将种子液移种至发酵罐发酵培养基中进行液体发酵培养，实时监控各发酵参数的变化；发酵培养60～80h，当CER、OUR、Kla同步下降时，开始流加补水和糖溶液；发酵培养4～6天后放罐，检测。所述的发酵法生产A40926的方法，步骤c)发酵罐接种量为8～12％，以25～32℃培养，罐压0.05Mpa，通气比1:1V/V/min，DO(溶解氧浓度)控制在30～100％，转速200-480rpm。本专利技术中，所述的产A40926的菌种为本领域常规所说的能够发酵生产A40926的菌种，优选为野野村氏菌属放线菌(Nonomuraeasp.)ATCC39727。本专利技术上述野野村放线菌的种子液是按常规的方法将野野村放线菌在种子培养基中培养而得到的。所述的种子培养基可以是现有的野野村放线菌的种子培养基，种子培养的温度较佳的是28℃。本专利技术所用的和补料发酵罐培养基均采用常规的实消灭菌。本专利技术所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。相比于现有的补料培养基和补料调控工艺，本专利技术的有益效果如下：本专利技术提供了一种基于代谢参数OUR和CER本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种发酵法生产A40926的方法，其特征在于，将通过种子培养基培养所得种子液接种至装有发酵培养基的发酵罐中，发酵过程实时监测OUR、CER和Kla，发酵中后期60～80h，当CER、OUR、Kla开始下降时，开始流加补水和糖溶液。

【技术特征摘要】
1.一种发酵法生产A40926的方法，其特征在于，将通过种子培养基培养所得种子液接种至装有发酵培养基的发酵罐中，发酵过程实时监测OUR、CER和Kla，发酵中后期60～80h，当CER、OUR、Kla开始下降时，开始流加补水和糖溶液。2.如权利要求1所述的发酵法生产A40926的方法，其特征在于，种子培养基按重量百分比计，包含以下组分：葡萄糖2％，燕麦粉2％，胰蛋白胨0.3％，FeSO4·7H2O0.001％，MnCl·4H2O0.001％，ZnSO4·7H2O0.001％，pH7.2。3.如权利要求1所述的发酵法生产A40926的方法，其特征在于，发酵培养基按重量百分比计，包含以下组分：玉米淀粉4％，糊精1.5％，葡萄糖2％，豆油1％，黄豆饼粉4％，胰蛋白胨1.5％，L-缬氨酸0.2％，碳酸钙0.5％，pH6.5。4.如权利要求1所述一种发酵法生产A40926的方法，其特征在于，所述糖为葡萄糖。5.如权利要求1所述一种发酵法生产A40926的方法，其特征在于，所述水为无菌水。6....

【专利技术属性】
技术研发人员：张贵民，刘志钰，沈进军，
申请(专利权)人：鲁南制药集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37