一种发酵生产两性霉素B的方法技术

本发明专利技术属于发酵工程领域，具体涉及一种提高微生物发酵生产两性霉素B产量的方法。该方法通过优化有机复合氮源和发酵条件，降低不同批次间氮源对发酵代谢的影响；通过添加前体物质，促进两性霉素B生物合成。发酵结束后，两性霉素B的发酵单位达到14469ug/ml。与优化前相比，两性霉素B产量提高103%，发酵时间缩短14%，提高了设备利用率，同时易于下游的纯化。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于发酵工程领域，具体涉及一种发酵生产两性霉素B的方法。
技术介绍
两性霉素B是由结节性链霉素发酵产生的，由37个碳原子构成的多烯大环内酯类抗生素，临床用于治疗由多种深部真菌如白色念珠菌、新型隐球菌、曲霉菌等引起的心脏或全身感染。对某些严重的深部真菌病如新生隐球菌脑膜炎、侵袭性曲霉病，特别是对免疫缺陷或严重粒细胞缺乏的患者的治疗以及某些地方性真菌病如球孢子菌病、组织胞浆菌病、皮炎芽生菌病等仍需应用两性霉素B，两性霉素B仍然是治疗侵袭性真菌感染的一线药物及“金标准”。两性霉素B为多烯大环内酯类抗生素，其生物合成途径为PKSI，可以分解为活化前体的生成（乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A)、内酯环的生成(多聚乙酰途径)和氨基糖的形成。在两性霉素B的生物合成途径中，内酯环的形成是限制性因素。内酯环的形成是以乙酸为起始单位、丙二酸为延续单位通过聚酮体途径缩合而成，这表明两性霉素B生物合成的重要前体物质是短链脂肪酸，这些脂肪酸前体物不易被菌体合成，因而成为限制两性霉素B生物合成的决定性因素。在两性霉素B发酵过程中加入前体物质是提高发酵单位的重要手段，通过补加前体物质，可以达到控制两性霉素B产生菌的生物合成方向及增加两性霉素B产量的目的。从外界补加前体物质，能明显地提高两性霉素B的发酵水平。但是，外源性前体物质在发酵液中的残留浓度过高，会使生产菌株中毒，不利于两性霉素B的生物合成；而前体物质不足也会大大影响两性霉素B的生产。因此，研究加入何种前体物质以及添加策略对两性霉素B的高产稳产具有重要的意义。工业发酵过程的调控往往是一个复杂的多因素问题，直接影响到发酵效价及目的产物的生产，是工业发酵中最核心的问题之一。利用微生物发酵生产两性霉素B，其培养基成分相当复杂。影响微生物代谢的因素除培养基成分外，还包括pH值、温度等操作条件，可变因子较多。因而选择合适、高效的优化方法显得尤为重要。有机氮源作为一种成分复杂而且组分不容易定量的培养基原料，对发酵过程影响很大。长期以来，工业发酵大都采用玉米浆等大宗农副产品作为有机氮源，不同厂家、不同批次有机氮源组分之间存在不稳定性和差异性，所以导致不同批次发酵代谢产物及代谢水平不一致，因此有机氮源的选取和使用是非常关键的。因此，如何调整两性霉素B发酵培养基的成分以及发酵条件，加入何种前提物质，加入的量以及加入时机的选择，成为如何提高微生物发酵生产两性霉素B产量的所迫切需要研究的课题。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决现有技术中微生物发酵制备两性霉素B存在的发酵过程不稳定及发酵水平低的问题，提供一种通过优化发酵培养基配方、发酵条件，在发酵过程中添加前体物质，促进两性霉素B的生物合成，来提高两性霉素B产量的方法。本专利技术的关键构思为：采用结节性链霉素菌株为出发菌株，在微生物发酵生产两性霉素B的过程中，优化初始pH值、发酵温度及时间、接种量等条件，优化新型复合有机氮源，在两性霉素B产物合成初期，添加前体物质，提高两性霉素B的产量。本专利技术所提供的一种发酵生产两性霉素B的方法，包括以下步骤：a、制备结节性链霉素菌株的种子液将结节性链霉素菌株的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基，26-30℃、在摇瓶或发酵罐中培养44-52h获得种子液。其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉20.0-30.0克、葡萄糖10.0-20.0克、热榨黄豆饼粉10.0-20.0克、酵母粉5.0-10.0克、玉米浆2.0-8.0克、氯化钠1.0-2.0克、碳酸钙3.0-4.0克，加水定容至1000mL，pH7.0-7.5，121℃灭菌30min。本专利技术所述两性霉素B产生菌可选用菌种编号ATCC14899的菌种。b.制备结节性链霉素菌株的发酵液将上述种子液以体积百分比6-15%的接种量接种于发酵培养基，在摇瓶或发酵罐中发酵，发酵24-50小时之间加入前体物质丙酸钠或正丙醇，继续发酵，总发酵时间120-140h，发酵温度26-30℃，得到发酵液。其中所述发酵培养基按以下方法制得：葡萄糖20.0-40.0克、玉米粉20.0-30.0克、热榨黄豆饼粉0-20.0克、棉籽蛋白粉0-30.0克、酵母粉0-10.0克、玉米浆5.0-8.0克、磷酸二氢钾0.5-0.8克、氯化钠1.0-2.0克、碳酸钙3.0-6.0克，加水定容至1000mL，pH7.0-8.0，121℃灭菌30min。其中所述步骤b中前体物质添加量为每升发酵液加入0.4-4克。其中所述前体物质添加时间为发酵30-40小时之间加入。其中所述步骤b中棉籽蛋白粉和酵母粉的质量比为6：1-3：1。其中步骤b中所述发酵为压力为0.05±0.01Mpa、搅拌速度为200-400rpm，通气比为1:0.8-1.2vvm。其中所述种子液以体积百分比8-10%的接种量接种于发酵培养基。其中所述种子液在种子培养基中培养46-48小时。其中所述发酵培养基的初始最适pH值为为7.3-7.6。其所述步骤b中中棉籽蛋白粉和酵母粉，比例为5:1-4:1。上述优选条件，所获得两性霉素B的产量从7131ug/ml提高到14469ug/ml，为两性霉素B的工业化生产提供了一种新的方法。本专利技术中通过优化发酵配方、新型复合有机氮源和发酵条件，保证了不同发酵批次间代谢产物及发酵水平的一致性；加入前体物质后可显著促进两性霉素B的生物合成。优化后两性霉素B产量提高103%，发酵时间缩短14%，提高了产能，缩短了生产周期，降低了能耗及三废排放。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明均为工业级原料；所用的棉籽蛋白粉由青岛科瑞提供，酵母粉由安琪酵母有限公司提供，丙酸钠、正丙醇由天津永大化学试剂有限公司提供。实施例1、10L自动发酵罐发酵制备两性霉素B结节性链霉素菌株种子液的制备将结节性链霉素菌株的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基，26℃、220rpm、培养48h获得种子液；其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉20.0克、葡萄糖20.0克、热榨黄豆饼粉10.0克、酵母粉10.0克、玉米浆8.0克、氯化钠1.0克、碳酸钙3.0克，加自来水定容至1000mL，pH7.0，121℃灭菌30min。本专利技术所述两性霉素B产生菌为菌种编号ATCC14899的菌种。发酵培养基组成：葡萄糖280.0克、玉米粉140.0克、热榨黄豆饼粉140.0克、玉米浆35.0克、磷酸二氢钾3.5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种发酵生产两性霉素B的方法，包括以下步骤：a、制备结节性链霉素菌株的种子液将结节性链霉素菌株的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基，26‑30℃、在摇瓶或发酵罐中培养44‑52 h获得种子液；其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉20.0‑30.0克、葡萄糖10.0‑20.0克、热榨黄豆饼粉10.0‑20.0克、酵母粉5.0‑10.0克、玉米浆2.0‑8.0克、氯化钠1.0‑2.0克、碳酸钙3.0‑4.0克，加水定容至1000mL，pH7.0‑7.5，121℃灭菌30min；b. 制备结节性链霉素菌株的发酵液将上述种子液以体积百分比6‑15 %的接种量接种于发酵培养基，在摇瓶或发酵罐中发酵，发酵24‑50小时之间加入前体物质丙酸钠或正丙醇，继续发酵，总发酵时间120‑140 h，发酵温度26 ‑30 ℃，得到发酵液；其中所述发酵培养基按以下方法制得：葡萄糖20.0‑40.0克、玉米粉20.0‑30.0克、热榨黄豆饼粉0‑20.0克、棉籽蛋白粉0‑30.0克、酵母粉0‑10.0克、玉米浆5.0‑8.0克、磷酸二氢钾0.5‑0.8克、氯化钠1.0‑2.0克、碳酸钙3.0‑6.0克，加水定容至1000mL，pH7.0‑8.0，121℃灭菌30min。...

【技术特征摘要】
1.一种发酵生产两性霉素B的方法，包括以下步骤：
a、制备结节性链霉素菌株的种子液
将结节性链霉素菌株的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基，26-30℃、在摇瓶或发
酵罐中培养44-52h获得种子液；
其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉20.0-30.0克、葡萄糖10.0-20.0克、
热榨黄豆饼粉10.0-20.0克、酵母粉5.0-10.0克、玉米浆2.0-8.0克、氯化钠1.0-2.0克、碳酸
钙3.0-4.0克，加水定容至1000mL，pH7.0-7.5，121℃灭菌30min；
b.制备结节性链霉素菌株的发酵液
将上述种子液以体积百分比6-15%的接种量接种于发酵培养基，在摇瓶或发酵罐中发
酵，发酵24-50小时之间加入前体物质丙酸钠或正丙醇，继续发酵，总发酵时间120-140h，
发...

【专利技术属性】
技术研发人员：段宝玲，张雪霞，王耀耀，任风芝，李宁，耿文飞，高任龙，郑智慧，路新华，
申请(专利权)人：华北制药集团新药研究开发有限责任公司，
类型：发明
国别省市：河北;13