缬氨霉素B及制备和医药用途制造技术

本发明专利技术提供一种具有抗胶质瘤活性的化合物缬氨霉素B，提供从海泥中分离培养到活性物质产生菌小链霉菌,并从中制备获得活性物质缬氨霉素B。所述的小链霉菌保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名为小链霉菌P11‑23B，(Streptomyces parvulus P11‑23B)保藏编号CCTCC NO：M 2015675，保藏日2015.11.12。缬氨霉素B具有显著抑制多种脑胶质瘤细胞增殖、明显阻滞胶质瘤细胞周期于G0/G1期、降低胶质瘤细胞不同代谢途径的多个关键酶的蛋白水平表达，具有独特的抗肿瘤作用。因此，缬氨霉素B可在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用。缬氨霉素B化学结构式为：

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属医药领域，涉及从海洋放线菌小链霉菌(Streptomyces parvulus P11-23B)中制备抗肿瘤活性化合物缬氨霉素B(Valinomycin B)的方法及该化合物在制备治疗脑胶质瘤药物方面的应用。
技术介绍
脑胶质瘤是脑颅内最常见和最恶性的脑肿瘤，占所有恶性脑肿瘤的70％。世界卫生组织统计数据表明：恶性胶质瘤是34岁以下肿瘤患者的第2位死亡原因，是35～54岁患者的第3位死亡原因，严重危害人类的健康及生命。胶质瘤由于所处的位置特殊，手术难度大而且不容易将肿瘤全部切除，所以放疗和药物对胶质瘤的治疗尤为重要。可是，目前抗胶质瘤药物严重缺乏，替莫唑胺是唯一可选择的单独用于胶质瘤治疗的药物。而且，包括替莫唑胺在内的现有治疗胶质瘤药物的疗效有限,多有严重不足,突出表现为:(1)多为化学品,毒副作用大；(2)肿瘤细胞对药物的严重耐药性；(3)血脑屏障阻碍了药物到达脑内发挥其疗效。因此，临床上需要克服以上缺陷，疗效更好、安全性更高和作用机制独特的新型抗胶质瘤药物。大量研究证明：过度的糖酵解(Glycolysis)、旺盛的谷氨酰胺分解(Glutaminolysis)和脂类合成(Lipogenesis)是胶质瘤细胞代谢不同于正常细胞代谢的突出特征。胶质瘤细胞从微环境中摄取大量葡萄糖在糖酵解环节由胶质瘤细胞特异依赖而高表达的多个关键酶包括己糖激酶2(HK2)、磷酸果糖激酶/果糖2,6-二磷酸酶(PFKFB3)、丙酮酸激酶M2(PKM2)和乳酸脱氢酶5(LDH5)等共同参与产生大量中间产物和终产物乳酸，这些中间产物是肿瘤细胞合成生物大分子的起始原料,而乳酸分泌至细胞外可抑制机体免疫细胞对肿瘤细胞的清除能力,可促进肿瘤细胞扩散,高表达的糖酵解关键酶HK2还可提高肿瘤细胞对放疗和替莫唑胺化疗的抗性。同时，谷氨酰胺酶(GLS)主导的旺盛的谷氨酰胺分解，为生物分子的合成提供大量的氮源，而高表达的脂肪酸合成酶(FASN)主导的活跃的脂类合成有利于细胞膜的生成。不难理解，正是肿瘤细胞高度利用其代谢中间产物合成生物大分子DNA、RNA、蛋白质和生物膜的能力促使其快速无限制地增殖,调控肿瘤代谢不同环节的关键酶可有效抑制肿瘤细胞的增殖。因此，靶向胶质瘤代谢不同环节关键酶的多靶点作用的药物可能具有更好的抗肿瘤疗效。缬氨霉素B(Valinomycin B)是从海洋细菌小链霉菌P11-23B(Streptomyces parvulus P11-23B)中分离得到的新化合物，该化合物对多种不同胶质瘤细胞的增殖具有显著的抑制作用，可明显降低胶质瘤细胞糖酵解、谷氨酰胺分解和脂类合成途径中数个关键酶的蛋白表达水平，具有独特的抗肿瘤作用机制，因此，缬氨霉素B在制备抗胶质瘤药物方面具有良好的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种具有抗胶质瘤活性的化合物缬氨霉素B(Valinomycin B，化合物1)，所述的缬氨霉素B为一新化合物，其化学结构式为：本专利技术的另一个目的是提供缬氨霉素B(Valinomycin B)的制备方法，通过以下步骤实现：(1)小链霉菌Streptomyces parvulus P11-23B发酵菌液的制备取链霉菌Streptomyces parvulus P11-23B的菌落接种到含有一定量的液体菌种培养基的大三角烧瓶中，将含有P11-23B菌种的培养液在室温条件下振荡培养一定时间后以制备菌种液。最后将菌种液转入含有一定量的液体发酵培养基的大三角烧瓶，在室温条件下振荡发酵培养一定时间后，得到具有抗肿瘤活性的P11-23B的发酵菌液。所述的液体菌种培养基和液体发酵培养基均为液体高氏培养基；所述的用量为100-200mL；所述的大三角培养瓶为250或500mL；所述的室温培养温度为20～30℃；所述振荡的转速为160-180rpm；所述的培养时间为5～15天。(2)缬氨霉素B(Valinomycin B)的提取分离纯化菌株P11-23B的发酵菌液用乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯萃取物，乙酸乙酯萃取物用十八烷基硅烷键合硅胶(ODS)柱层析分离，分别用70％和100％的甲醇洗脱，100％的甲醇洗脱液合并后经减压浓缩得到的残留物用HPLC分离，得到纯化合物缬氨霉素B(Valinomycin B)。所述柱层析的ODS用量与上量的样品量比例是40～60g:1.0g；所述的高效液相分离条件是:Agilent 1260高效液相色谱仪，Agilent 1260DAD检测器，Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(250×9.4mm,5μm)，100％甲醇为流动相，柱温26℃,检测波长210nm，流速为1.0mL/min。(3)缬氨霉素B(Valinomycin B)的结构鉴定缬氨霉素B(Valinomycin B)的结构是根据它们的一维和二维的NMR光谱、高分辨质谱数据、以及化学降解等方法来鉴定的。本专利技术的第三个目的是提供一种小链霉菌P11-23B，所述的菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名为小链霉菌P11-23B(Streptomyces parvulus P11-23B)，保藏编号CCTCC NO：M 2015675，保藏日2015.11.12，保藏地址：中国武汉。本专利技术的第四个目的是提供所述的小链霉菌P11-23B的制备方法，是一种从海泥中分离具有抗胶质瘤活性的菌株P11-23B的方法，通过以下步骤分离培养而获得：(1)小链霉菌(Streptomyces parvulus P11-23B)的分离培养取空气干燥的海泥用海水稀释成一定的浓度，取一定量的样品稀释液均匀分散到含有固体培养基的培养皿中，在室温条件下培养一定时间后,将不同的菌落分别转移到另一含有固体培养基的培养皿中，在室温条件下继续培养一定时间。最后将生长良好的单一菌落(P11-23B)接种到斜面培养基培养后置4℃冰箱保存备用。所述的海泥和海水是从浙江舟山东海海域中获得；所述样品稀释液的浓度为1×10-6～1×10-4g/mL；所述的样品稀释液的取样量为100～300μL；所述培养皿所含的固体培养基为高氏琼脂(Gause′s agar)培养基或其它固体培养基；所述的斜面培养基为高氏琼脂培养基或其它固体斜面培养基；所述的室温培养温度为20～30℃；所述的培养时间为7～15天。(2)小链霉菌(Streptomyces parvulus P11-23B)的菌种鉴定上述步骤(1)分离培养所获得的菌株用目前实验室普遍使用的16S rDNA序列分析方法鉴定菌株P11-23B的种类，确定为小链霉菌，分类命名为Streptomyces parvulus P11-23B，已被中国典型培养物保藏中心-武汉中心保藏，保藏编号CCTCC NO：M 2015675。本专利技术的第五个目的是提供缬氨霉素B在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用。所述的缬氨霉素B可显著抑制多种胶质瘤细胞的增殖，阻滞胶质瘤细胞周期于G0/G1期，降低胶质瘤细胞糖酵解、谷氨酰胺分解和脂类合成途径中多个关键酶的蛋白水平表达，具有独特的肿瘤作用机制。所述药物为缬氨霉素B活性成分单独，或缬氨霉素B与其它药物或与有效成分一起，与药学上可接受的载体组成的药物。所述药物的制剂形式为：液体制剂、固体制剂、胶囊制本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗胶质瘤活性物质缬氨霉素B(Valinomycin B)，其特征在于，具有以下化学结构式：

【技术特征摘要】
1.一种抗胶质瘤活性物质缬氨霉素B(Valinomycin B)，其特征在于，具有以下化学结构式：2.一种小链霉菌P11-23B，其特征在于，所述的小链霉菌菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名为小链霉菌P11-23B(Streptomyces parvulus P11-23B)，保藏编号CCTCC NO：M 2015675，保藏日2015.11.12，保藏地址：中国武汉。3.权利要求1所述的抗胶质瘤活性物质缬氨霉素B的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：(1)小链霉菌P11-23B(Streptomyces parvulus P11-23B)发酵菌液的制备：取小链霉菌P11-23B的菌落接种到含有一定量的液体菌种培养基的大三角烧瓶中，将含有P11-23B菌种的培养液在室温条件下振荡培养一定时间后以制备菌种液，最后将菌种液转入含有一定量的液体发酵培养基的大三角烧瓶，在室温条件下振荡发酵培养一定时间后，得到具有抗肿瘤活性的P11-23B的发酵菌液；所述的液体菌种培养基和液体发酵培养基均为液体高氏培养基；所述的用量为100-200mL；所述的大三角培养瓶为250或500mL；所述的室温培养温度为20～30℃；所述的振荡的转速为160-180rpm；所述的培养时间为5～15天；(2)缬氨霉素B的提取分离纯化菌株P11-23B的发酵菌液用乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯萃取物，乙酸乙酯萃取物用十八烷基硅烷键合硅胶(ODS)柱层析分离，分别用70％和100％的甲醇洗脱，100％的甲醇洗脱液合并后经减压浓缩得到的残留物用HPLC分离，得到纯化合物缬氨霉素B；所述柱层析的十八烷基硅烷键合硅胶用量与上量的样品量比例是40～60g：1.0g；所述的高效液相分离条件是:Agilent 1260高效液相色谱仪，Agilent 1260DAD检测器，Agilent Zorbax SB-C18色谱柱250×9.4...

【专利技术属性】
技术研发人员：张治针，叶雪威，连晓媛，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33