AGSE缺陷菌株制造技术

本发明专利技术涉及突变微生物宿主细胞，如果与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比并且在相同条件下测量，所述突变微生物宿主细胞在AgsE蛋白质产生或其同源物产生上缺陷。已意外地发现，如果与使用未被修饰的亲本宿主细胞的方法相比，在相同条件下测量时，根据本发明专利技术所述的突变微生物宿主细胞用于生成目标化合物例如酶的方法中时获得产率提高的所述化合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】AGSE缺陷菌株
本专利技术涉及优选在其基因组中被修饰以导致多肽生成缺陷的突变微生物宿主细胞，涉及生成所述突变微生物宿主细胞的方法和使用所述突变微生物宿主细胞生成目标化合物的方法。
技术介绍
不同的宿主细胞类型可用于不同的工业用途。例如：哺乳动物细胞系用于抗体生产；真菌细胞是用于生产多肽和次级代谢产物的优选生物；细菌细胞优选用于小代谢产物和抗生素生产；而植物细胞优选用于口感和风味化合物。重组技术广泛用于优化这种宿主细胞的生产率和/或使用这种宿主细胞的工艺。这可涉及许多选择。一些技术将针对编码目标化合物的目标基因在宿主细胞中的过表达。可按几种方式调节基因表达。例如可将目标基因置于宿主细胞中，受适合所述细胞的强启动子的表达控制。后者可通过质粒或载体介导的转化将表达盒引入宿主细胞中进行。然后可通过在表达盒中所含启动子正常作用所必需的诱导条件下，培养转化的宿主细胞实现目标化合物的生成。例如，US57228547描述了DNA构建体用于转化曲霉菌(Aspergillus)以在其中获得多肽表达的用途，其中DNA构建体包含用于在曲霉菌中促进转录并且与编码所述多肽的DNA可操作地连接的诱导型启动子DNA。已知转录激活子是促进RNA聚合酶与控制目标基因表达的启动子结合的调节蛋白。可以通过例如以下来调节基因表达：使用生成更高量的特异性转录激活子的突变宿主细胞，导致在受所述转录激活子激活的启动子控制下的目标基因表达增加。在例如WO2006/040312中描述了这种方法，提到了PrtT转录激活子及其用途。在另一替代性方法中，可通过增加用于表达基因的宿主细胞中目标基因的拷贝数来提高基因表达。然而，宿主细胞中存在的基因拷贝数是限制因素，因为包含大量待表达基因拷贝的重组宿主细胞可能变得不稳定。在WO9846772中给出了这个问题的解决方案，其描述了包含多个基本同源的DNA结构域的稳定丝状真菌，其中在所述结构域的至少2个中，存在编码目标化合物的重组DNA分子的整合的拷贝。还有其他旨在提高宿主细胞对目标化合物的生产率的方法可涉及缺失或灭活竞争途径、改变酶的区室化(compartmentalization)、增加蛋白质或代谢产物分泌、增加细胞器含量(organellecontent)等。尽管在对宿主细胞中目标化合物的表达的理解上有进展，但是仍然需要在商业或工业规模上，增加重要目标化合物的生成的方法。令人惊讶的是，我们已经发现下调微生物宿主细胞、例如表达目标化合物(例如目标酶)的丝状真菌宿主细胞中的agsE基因导致所述宿主细胞对所述酶的生成增加。专利技术概述本专利技术涉及一种突变微生物宿主细胞，其优选在其基因组中被修饰，从而如果与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比并且在相同条件下测量时导致选自以下的多肽的生成缺陷：a.根据SEQIDNO:3的多肽或与其至少70％相同的多肽，优选具有根据SEQIDNO:3的多肽的至少一种活性的与其至少70％相同的多肽；b.SEQIDNO:3中包含的成熟多肽或与其至少70％相同的多肽，优选具有SEQIDNO:3中包含的成熟多肽的至少一种活性的与其至少70％相同的多肽；c.根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸编码的或与SEQIDNO:1或2至少70％相同的多核苷酸编码的多肽，其中根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸编码的所述多肽优选具有SEQIDNO:1或2编码的多肽的至少一种活性；d.能够与根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸杂交或能够与SEQIDNO:1或2的互补链杂交的多核苷酸编码的多肽，其中所述多肽优选具有SEQIDNO:1或2编码的多肽的至少一种活性。本专利技术进一步涉及一种生成根据本专利技术所述的突变微生物宿主细胞的方法，其包括以下步骤：a.提供亲本微生物宿主细胞；b.修饰所述亲本微生物宿主细胞，优选修饰所述亲本微生物宿主细胞的基因组，从而产生如果与亲本微生物宿主细胞相比并且在相同条件下测量时选自以下的多肽的生成上缺陷的突变微生物宿主细胞：(i)根据SEQIDNO:3的多肽或与其至少70％相同的多肽，优选具有根据SEQIDNO:3的多肽的至少一种活性的与其至少70％相同的多肽；(ii)SEQIDNO:3中包含的成熟多肽或与其至少70％相同的多肽，优选具有SEQIDNO:3中包含的成熟多肽的至少一种活性的与其至少70％相同的多肽；(iii)根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸编码的或与SEQIDNO:1或2至少70％相同的多核苷酸编码的多肽，其中根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸编码的所述多肽优选具有SEQIDNO:1或2编码的多肽的至少一种活性；(iv)能够与根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸杂交或能够与SEQIDNO:1或2的互补链杂交的多核苷酸编码的多肽，其中所述多肽优选具有SEQIDNO:1或2编码的多肽的至少一种活性。本专利技术也涉及通过微生物发酵生成目标化合物的方法，其包括：a.提供能够表达所述目标化合物的根据本专利技术所述的或根据生成本专利技术所述的突变微生物宿主细胞的方法生成的突变微生物宿主细胞，b.在有益于表达所述目标化合物的条件下培养所述微生物宿主细胞，c.任选地从培养基中分离所述目标化合物。附图说明图1描绘了pGBTOPGOX-3，其为用于表达产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)葡萄糖氧化酶基因的基于pGBTOP-12的质粒，具有受葡糖淀粉酶启动子驱动的表达与在经改造BamHI扩增子中靶向整合的布局。图2描绘了pGBTOPLIP-2，其为用于表达L01脂肪酶(如WO2009/106575所述)的基于pGBTOP-12的质粒，具有克隆在其中的L01基因和受葡糖淀粉酶启动子驱动的表达与在经改造BamHI扩增子中靶向整合的布局。图3描绘了pGBTOPPLA-2，其为用于表达猪磷脂酶A2(PLA2)的基于pGBTOP-12的质粒，具有克隆在其中的GLA-PLA2编码基因和受葡糖淀粉酶启动子驱动的表达与在经改造BamHI扩增子中靶向整合的布局。图4描绘了pGBDEL-AMY1，其为用于缺失编码淀粉酶的agdB基因的质粒，具有其他缺失构建体(即pGBDEL-AMY2和pGBDEL-AMY4)的代表布局。图5描绘了在不同菌株的培养上清液中测量的相对葡萄糖氧化酶活性。第4天PGOX-2参考菌株的活性被设为100％水平。图6描绘了不同突变菌株板上的葡萄糖氧化酶活性。在1％麦芽糖上生长并且在生长4天后，用邻茴香胺染色。图7描绘了第4天在所示不同菌株的培养上清液中测量的相对脂肪酶活性。将两个LIP2参考菌株之一的活性设为100％水平。图8描绘了在发酵所示菌株5天后，在培养上清液中测量的相对PLA2活性。将PLA2参考菌株的活性设为100％水平。序列表描述SEQIDNO:1列出了来自黑曲霉(Aspergillusniger)的agsE基因的基因组序列，包括2kb上游和下游侧翼区。所述基因组序列包含根据SEQIDNO:2的cDNA序列。SEQIDNO:2列出了来自黑曲霉的agsE基因的cDNA序列。SEQIDNO:3列出了来自黑曲霉的AgsE蛋白质的氨基酸序列。SEQIDNO:4列出了与SEQIDNO:3的第20-2426位氨基酸相对应的成熟AgsE蛋白质的氨基酸序列。SEQIDNO:5列出了来自黑本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种突变微生物宿主细胞，其已被修饰，优选在其基因组中被修饰，以导致如果与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比并且在相同条件下测量时，在选自以下的多肽的生成上缺陷：a.根据SEQ ID NO:3的多肽或与其至少70％相同并且具有根据SEQ ID NO:3的多肽的至少一种活性的多肽；b.SEQ ID NO:3中包含的成熟多肽或与其至少70％相同并且具有SEQ ID NO:3中包含的成熟多肽的至少一种活性的多肽；c.根据SEQ ID NO:1或2的多核苷酸编码的或与SEQ ID NO:1或2至少70％相同的多核苷酸编码的多肽，其中根据SEQ ID NO:1或2的多核苷酸编码的所述多肽具有根据SEQ ID NO:1或2的多核苷酸编码的多肽的至少一种活性；d.能够与根据SEQ ID NO:1或2的多核苷酸杂交或能够与SEQ ID NO:1或2的互补链杂交的多核苷酸编码的多肽，其中所述多肽具有根据SEQ ID NO:1或2的多核苷酸编码的多肽的至少一种活性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.07.19 EP 12177172.9;2012.07.19 US 61/673,5961.一种突变微生物宿主细胞，其中所述突变微生物宿主细胞是选自黑曲霉（Aspergillusniger）、泡盛曲霉（Aspergillusawamori）、臭曲霉（Aspergillusfoetidus）、酱油曲霉（Aspergillussojae）、烟曲霉（Aspergillusfumigatus）和米曲霉（Aspergillusoryzae）物种的曲霉菌（Aspergillus），其已在其基因组中被修饰，以导致与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比并且在相同条件下测量时，在选自以下的多肽的生成上缺陷：a.根据SEQIDNO:3的多肽或与其至少85%相同并且具有根据SEQIDNO:3的多肽的至少一种活性的多肽；b.SEQIDNO:3中包含的成熟多肽或与其至少85%相同并且具有SEQIDNO:3中包含的成熟多肽的至少一种活性的多肽；c.根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸编码的或与SEQIDNO:1或2至少85%相同的多核苷酸编码的多肽，其中根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸编码的所述多肽具有根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸编码的多肽的至少一种活性；其中根据a.-c.所述的多肽具有a-1,3-葡聚糖合酶[EC2.4.1.183]酶活性,其中所述突变微生物宿主细胞包含编码目标化合物的至少一种多核苷酸或编码在目标化合物的生成中所涉及的化合物的至少一种多核苷酸，其中编码目标化合物的所述至少一种多核苷酸或编码在目标化合物的生成中所涉及的化合物的所述至少一种多核苷酸与启动子可操作地连接，其中所述目标化合物是酶，其中其基因组中的所述修饰选自：i）完全或部分缺失c.中定义的多核苷酸；ii）用不编码a.-c.中定义的多肽或编码a.至c.中所定义多肽的部分或完全失活形式的多核苷酸序列完全或部分置换c.中定义的多核苷酸；iii）通过在多核苷酸序列中插入一个或更多个核苷酸来破坏c.中所定义的多核苷酸，从而部分或完全失活a.至c.中所定义的多肽。2.根据权利要求1所述的突变微生物宿主细胞，其中SEQIDNO:3中包含的所述成熟多肽为根据SEQIDNO:4的成熟多肽。3.根据前述权利要求中任一项所述的突变微生物宿主细胞，其中所述修饰包括：a）与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比，在相同条件下分析时，导致权利要求1a.-1c.中定义的多肽生成减少或不生成的修饰，和/或b）与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比，在相同条件下分析时，生成活性降低或没有活性的源自权利要求1a.-1c.所定义多肽的修饰。4.根据权利要求1或2所述的突变微生物宿主细胞，其中编码目标化合物的所述至少一种多核苷酸或编码在目标化合物的生成中所涉及的化合物的所述至少一种多核苷酸与诱导型启动子可操作地连接。5.根据权利要求1或2所述的突变微生物宿主细胞，其中所述启动子为碳水化合物诱导型启动子。6.根据权利要求5所述的突变微生物宿主细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：诺尔·尼克拉斯·玛利亚·伊丽莎白·范·佩吉，马帝那·贝舒森，彼得·约瑟夫·艾达·范德·沃恩德沃尔特，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL