【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程，尤其是指一种基于重组无序蛋白的无膜细胞器及其构建方法与应用。
技术介绍
1、如何实现微生物胞内代谢网络的空间水平调控是构建新一代高性能细胞工厂的关键前提。研究表明，将途径酶招募固定形成微反应区室，能够有效缩短生物分子的空间距离，提高中间代谢物的传输速率，进而增强催化过程的整体效率。生物分子凝聚体是一种新型的亚细胞结构，在调节细胞行为、信号传导等方面发挥着重要作用。生物分子凝聚体通常是固有无序蛋白或其他生物分子(核酸等)在多价相互作用的介导下，经液-液相分离过程而形成。与膜包被细胞器或蛋白外壳微区室相比，生物分子凝聚体因其固有的液体特性，可以自由地与外部环境交换目标生物分子。因此，生物分子凝聚体可以作为无膜细胞器实现生物过程的空间维度调控。
2、作为gras(generally regard as safe)革兰氏阳性宿主，枯草芽孢杆菌(b.subtilis)已被广泛用于l-天冬酰胺酶，透明质酸以及核黄素等高附加值化合物的生物合成。然而，目前尚未有在b.subtilis中构建应用人工无膜细胞器的报道。此外，使用天然固有无序蛋白(idps)会限制生物分子凝聚体的可编程性，且无法实现正交性。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题在于如何设计能够形成生物分子凝聚体的重组无序蛋白并验证其是否能够在b.subtilis中形成功能性的无膜细胞器。本专利技术提供了一种基于重组无序蛋白的无膜细胞器及其应用，首先从头设计了八肽基本元件并得到了重组无序蛋白，
2、本专利技术的第一个目的是提供一种重组无序蛋白，含有重复串联的肽段n8，所述肽段n8由八个氨基酸组成，其中包括三个甘氨酸、一个脯氨酸、一个丝氨酸、一个天冬氨酸、一个精氨酸、一个酪氨酸或丙氨酸。
3、进一步地，肽段n8的氨基酸序列可选自以下任意一种：
4、(1)rgygspdg(seq id no.1)；
5、(2)rggdspyg(seq id no.2)；
6、(3)rgspygdg(seq id no.3)；
7、(4)gypsdgrg(seq id no.4)；
8、(5)dgrgspyg(seq id no.5)；
9、(6)rgagspdg(seq id no.6)。
10、进一步地，重组无序蛋白的序列为mskgp-(n8)n-gy，n为15-30之间的任意整数。
11、优选地，n为20。
12、本专利技术的第二个目的是提供一种无膜细胞器，构建含有上述重组无序蛋白的表达载体并导入表达宿主中，表达形成无膜细胞器。
13、进一步地，使用诱导型启动子或组成型启动子表达重组无序蛋白。
14、优选地，重组无序蛋白由pgrac启动子表达。
15、进一步地，使用iptg进行诱导表达。
16、进一步地，iptg浓度为0.05-0.5mm，诱导温度为37-42℃，诱导时间为6-10小时。
17、本专利技术的第三个目的是提供一种含有上述重组无序蛋白或上述无膜细胞器的宿主细胞。
18、进一步地，宿主为枯草芽孢杆菌。
19、优选地，宿主为枯草芽孢杆菌bacillus subtilis 168。
20、本专利技术的第四个目的是提供一种利用上述无膜细胞器招募目标蛋白的方法。
21、进一步地，无膜细胞器靶向目标蛋白。
22、进一步地，在目的蛋白的n端或c端连接多肽标签或标签配体，在无膜细胞器的n端或c端连接标签配体或多肽标签，多肽标签和标签配体共价结合。
23、进一步地，多肽标签为ridd短肽或ccdia短肽，标签配体为riad短肽或ccdib短肽。
24、进一步地，无膜细胞器与标签配体通过连接肽连接。
25、进一步地，连接肽的序列如式(ggggs)n所示，其中n为大于等于1的整数。
26、本专利技术的第五个目的是提供上述无膜细胞器在空间水平上调控目标化合物代谢合成中的应用。
27、本专利技术的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
28、本专利技术基于液-液相分离形成机制与原理，首次在枯草芽孢杆菌中构建与应用了无膜细胞器。从头设计了八肽基本元件，重复肽段构建获得重组无序蛋白，并结合分子模拟理论计算与实验验证其能够形成具有液体特性的生物分子凝聚体，该凝聚体经荧光漂白后在210s内可恢复83％的荧光强度。对重组无序蛋白的氨基酸序列组成与排序进行理性设计以调控多价相互作用强度，进而获得了系列可形成具有不同流动性的生物分子凝聚体的重组无序蛋白，实现了生物分子凝聚体的可编程性。在b.subtilis胞内构建了无膜细胞器，并通过实验证明其具有良好的流动性、稳定性与温敏性，通过可视化实验进一步证明了b.subtilis胞内的生物分子凝聚体允许小分子化合物的扩展渗透，且能够招募特定靶向蛋白，实现了在芽孢杆菌内调节目标化合物的代谢通量。
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1.一种重组无序蛋白，其特征在于：所述重组无序蛋白含有重复串联的肽段N8，所述肽段N8由八个氨基酸组成，其中包括三个甘氨酸、一个脯氨酸、一个丝氨酸、一个天冬氨酸、一个精氨酸、一个酪氨酸或丙氨酸。
2.根据权利要求1所述的重组无序蛋白，其特征在于，所述肽段N8的氨基酸序列可选自以下任意一种：
3.根据权利要求1所述的重组无序蛋白，其特征在于，所述重组无序蛋白含有以下序列MSKGP-(N8)n-GY，n为15-30之间的任意整数。
4.一种无膜细胞器，其特征在于：构建含有权利要求1所述重组无序蛋白的表达载体并导入表达宿主中，表达形成所述无膜细胞器。
5.根据权利要求4所述的无膜细胞器，其特征在于：使用诱导型启动子或组成型启动子表达所述重组无序蛋白。
6.根据权利要求5所述的无膜细胞器，其特征在于：使用IPTG进行诱导表达。
7.根据权利要求6所述的无膜细胞器，其特征在于：IPTG浓度为0.05-0.5mM，诱导温度为37-42℃，诱导时间为6-10小时。
8.一种含有如权利要求1-3任一所述的重组无序
9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于：所述宿主为枯草芽孢杆菌。
10.一种利用权利要求4所述的无膜细胞器招募目标蛋白的方法。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述无膜细胞器靶向目标蛋白。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：在目的蛋白的N端或C端连接多肽标签或标签配体，在无膜细胞器的N端或C端连接标签配体或多肽标签，多肽标签和标签配体特异性结合。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述多肽标签为RIDD短肽或CCDIA短肽，所述标签配体为RIAD短肽或CCDIB短肽。
14.权利要求1所述的重组无序蛋白、权利要求4所述的无膜细胞器、权利要求7所述的宿主细胞或权利要求10所述的方法在调控目标化合物代谢中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种重组无序蛋白，其特征在于：所述重组无序蛋白含有重复串联的肽段n8，所述肽段n8由八个氨基酸组成，其中包括三个甘氨酸、一个脯氨酸、一个丝氨酸、一个天冬氨酸、一个精氨酸、一个酪氨酸或丙氨酸。
2.根据权利要求1所述的重组无序蛋白，其特征在于，所述肽段n8的氨基酸序列可选自以下任意一种：
3.根据权利要求1所述的重组无序蛋白，其特征在于，所述重组无序蛋白含有以下序列mskgp-(n8)n-gy，n为15-30之间的任意整数。
4.一种无膜细胞器，其特征在于：构建含有权利要求1所述重组无序蛋白的表达载体并导入表达宿主中，表达形成所述无膜细胞器。
5.根据权利要求4所述的无膜细胞器，其特征在于：使用诱导型启动子或组成型启动子表达所述重组无序蛋白。
6.根据权利要求5所述的无膜细胞器，其特征在于：使用iptg进行诱导表达。
7.根据权利要求6所述的无膜细胞器，其特征在于：iptg浓度为0.05-0.5mm，...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，陈坚，吕雪芹，堵国成，李江华，刘延峰，于文文，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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