【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程，具体涉及一株nadc30-like猪繁殖与呼吸综合征病毒强毒株感染性克隆病毒及其应用，尤其涉及拯救以及改造获得的适应marc-145细胞的嵌合病毒。
技术介绍
1、猪繁殖与呼吸综合征(prrs)是引起母猪流产和仔猪呼吸道综合征的重要传染病之一，该病给全世界养猪业造成巨大的经济损失。prrs的病原是猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)。prrsv可分为两个种(species)：prrsv1和prrsv2。近年来，我国流行的是prrsv2。以hp-prrsv、nadc30-like prrsv和nadc34-like prrsv为主。其中，nadc30-like prrsv的毒力强，传染性强，在我国多个省市流行，是我国目前流行率最高的毒株，给我国生猪健康养殖造成了严重危害。
2、prrsv2属于动脉炎病毒科，是一种单股正链的rna病毒，其基因组大小约为15kb。包含至少10个开放阅读框(orf)。orf1a和orf1b基因编码至少16个非结构蛋白，orf2-7基因编码8个结构蛋白。其中，orf2-4基因编码的三种小囊膜蛋白(gp2a、gp3和gp4)在决定prrsv毒株细胞嗜性中发挥关键作用。
3、疫苗免疫是防控prrs疫情的有效手段。但目前我国的商品化prrsv弱毒疫苗(jxa1-r、r98和hun-f112等)对nadc30-like prrsv的交叉保护效果差。此外，marc-145细胞系是用于prrsv疫苗生产的传代细胞系，而nadc30-like prrsv野毒株不能适应ma
技术实现思路
1、专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是提供了一种感染性克隆质粒pacyc177-rsd17-38及其构建方法。
2、本专利技术所要解决的技术问题是提供了一种感染性克隆病毒及其构建方法。
3、本专利技术还要解决的技术问题是提供了一种可适应marc-145细胞体外培养的nadc30-like prrsv改造毒株。
4、本专利技术还要解决的技术问题是提供了所述的感染性克隆质粒pacyc177-rsd17-38、所述的感染性克隆病毒或所述的改造毒株在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒的疫苗中的应用。
5、本专利技术最后要解决的技术问题是提供了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的疫苗。
6、技术方案：为了解决上述技术问题，本专利技术提供了所述感染性克隆质粒是将中间载体与基因片段f4连接得到，所述中间载体是将基因片段f1、f2和f3通过同源重组的方式与质粒pacyc177连接得，所述基因片段f1、f2、f3和f4依次位于nadc30-like prrsv sd17-38病毒的全基因组的第1～1525位核苷酸、第1481-7891位核苷酸、第7844-12371位核苷酸和第12321-15177位核苷酸。
7、本
技术实现思路
还包括所述的感染性克隆质粒pacyc177-rsd17-38的构建方法，包括以下步骤：
8、1)分别设计基因片段f1、f2、f3的引物对，然后分别进行扩增得到sd17-38-f1、sd17-38-f2和sd17-38-f3片段；
9、2)设计基因片段f4的引物对，首先使用sd17-38-bsp1407if4和sd17-38-4r1引物对，扩增得到f4-1，然后，以f4-1作为模板，使用引物sd17-38-bsp1407if4和3’端加入丁型肝炎病毒的基因序列(seq id no.1)的引物sd17-38-asci-4r2组合，扩增得到f4；
10、3)将pacyc177质粒通过pacⅰ和bsp1407ⅰ双酶切线性化，再将f1、f2和f3片段与该线性化载体同源重组得到连接上f1、f2和f3片段的质粒pacyc177-rsd17-38-f1+f2+f3，然后将pacyc177-rsd17-38-f1+f2+f3质粒和f4片段通过bsp1407ⅰ和ascⅰ双酶切，再将f4片段与该载体通过酶切连接法得到完整的pacyc177-rsd17-38质粒。
11、其中，所述同源重组的体系为f1片段20～40ng、f2片段为100～200ng、f3片段为50～150ng和pacyc177线性化载体100～300ng，再添加1μl exanse multis和5×ce multisbuffuer 2μl，条件为37℃30min。
12、本
技术实现思路
还包括一种感染性克隆病毒，所述感染性克隆是将所述的质粒转染细胞后，再通过感染易感细胞得到。
13、本
技术实现思路
还包括所述的感染性克隆病毒的拯救方法，包括以下步骤：将所述的pacyc177-rsd17-38质粒转染到bhk-21细胞中，得到的转染液再接种原代pam细胞，培养数天后，得到拯救的感染性克隆病毒。
14、本
技术实现思路
还包括可适应marc-145细胞体外培养的nadc30-like prrsv改造毒株，其特征在于，所述改造毒株是将所述的感染性克隆病毒的小囊膜蛋白的部分编码基因替换为hp-prrsv xj17-5分离株的小囊膜蛋白的部分编码基因。
15、其中，替换后的所述小囊膜蛋白的部分编码基因包括xj17-5株orf2-orf3-orf4或xj17-5株orf2的第1-191位氨基酸的编码基因，所述xj17-5株orf2-orf3-orf4的基因序列如seq id no.2的第1-1705位核苷酸，所述xj17-5株orf2的基因序列如seq id no.2的第1-573bp位核苷酸。
16、本
技术实现思路
还包括所述的感染性克隆质粒pacyc177-rsd17-38、所述的感染性克隆病毒或所述的改造毒株在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒的疫苗中的应用。
17、本
技术实现思路
还包括一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的疫苗，所述疫苗包括所述的感染性克隆病毒或所述的改造毒株。
18、综上，本专利技术一方面提供了nadc30-like prrsv的反向遗传操作平台及其构建方法。具体包括以pacy177质粒为载体，利用pcr扩增、酶切连接及同源重组等方法将nadc30-like prrsv sd17-38强毒株的全基因组分段连接到载体上，获得sd17-38全长感染性克隆，构建并拯救了感染性克隆病毒rsd17-38，成功搭建了首个nadc30-like prrsv强毒株感染性克隆平台。
19、本专利技术的另一个方面，提供了改造获得可适应marc-145细胞传代培养nadc30-like prrsv毒株的方法。具体包括以本专利技术中nadc30-like prrsv反向遗传操作平台为基础，利用同源重组等方法将marc-145细胞适应株xj17-5的小囊膜蛋白合成基因orf2-orf3-orf4序列及gp2a-1-191aa替换到nadc30-本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种感染性克隆质粒pACYC177-rSD17-38，其特征在于，所述感染性克隆质粒是将中间载体与基因片段F4连接得到，所述中间载体是将基因片段F1、F2和F3通过同源重组的方式与质粒pACYC177连接得到，所述基因片段F1、F2、F3和F4依次位于NADC30-like PRRSVSD17-38病毒的全基因组的第1~1525位核苷酸、第1481-7891位核苷酸、第7844-12371位核苷酸和第12321-15177位核苷酸。
2.权利要求1所述的感染性克隆质粒pACYC177-rSD17-38的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述同源重组的体系为F1片段20~40ng、F2片段为100~200ng、F3片段为50~150ng和pACYC177线性化载体100~300ng，再添加1μL Exanse MultiS和5×CE MultiS Buffuer 2μL，条件为37℃30min。
4.一种感染性克隆病毒，其特征在于，所述感染性克隆是将权利要求1所述的质粒转染细胞后，再通过感染易
5.权利要求4所述的感染性克隆病毒的拯救方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1所述的pACYC177-rSD17-38质粒转染到BHK-21细胞中，得到的转染液再接种原代PAM细胞，培养数天后，得到拯救的感染性克隆病毒。
6.可适应Marc-145细胞体外培养的NADC30-like PRRSV改造毒株，其特征在于，所述改造毒株是将权利要求4所述的感染性克隆病毒的小囊膜蛋白的部分编码基因替换为HP-PRRSV XJ17-5分离株的小囊膜蛋白的部分编码基因。
7.根据权利要求6所述的可适应Marc-145细胞体外培养的NADC30-like PRRSV改造毒株，其特征在于，替换后的所述小囊膜蛋白的部分编码基因包括XJ17-5株ORF2-ORF3-ORF4或XJ17-5株ORF2的第1-191位氨基酸的编码基因，所述XJ17-5株ORF2-ORF3-ORF4的基因序列如SEQ ID NO.2 的第1-1705位核苷酸，所述XJ17-5株ORF2的基因序列如SEQ ID NO.2 的第1-573bp位核苷酸。
8.权利要求1所述的感染性克隆质粒pACYC177-rSD17-38、权利要求4所述的感染性克隆病毒、权利要求6~7任一项所述的改造毒株在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒的疫苗中的应用。
9.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的疫苗，其特征在于，所述疫苗包括权利要求4所述的感染性克隆病毒或权利要求6~7任一项所述的改造毒株。
...【技术特征摘要】
1.一种感染性克隆质粒pacyc177-rsd17-38，其特征在于，所述感染性克隆质粒是将中间载体与基因片段f4连接得到，所述中间载体是将基因片段f1、f2和f3通过同源重组的方式与质粒pacyc177连接得到，所述基因片段f1、f2、f3和f4依次位于nadc30-like prrsvsd17-38病毒的全基因组的第1~1525位核苷酸、第1481-7891位核苷酸、第7844-12371位核苷酸和第12321-15177位核苷酸。
2.权利要求1所述的感染性克隆质粒pacyc177-rsd17-38的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述同源重组的体系为f1片段20~40ng、f2片段为100~200ng、f3片段为50~150ng和pacyc177线性化载体100~300ng，再添加1μl exanse multis和5×ce multis buffuer 2μl，条件为37℃30min。
4.一种感染性克隆病毒，其特征在于，所述感染性克隆是将权利要求1所述的质粒转染细胞后，再通过感染易感细胞得到。
5.权利要求4所述的感染性克隆病毒的拯救方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1所述的pacyc177-rsd17-38质粒转染...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈南华，邱明，李鑫帅，林鸿，朱建中，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：
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