粘多糖贮积症II型动物模型的构建方法及应用技术

本发明专利技术提供了粘多糖贮积症II型动物模型的构建方法，包括针对小鼠IDS基因设计靶点，合成寡核苷酸链，合成的寡核苷酸链经退火与pUC57‑T7‑sgRNA质粒进行连接，获得sgRNA表达载体；获得小鼠受精卵；将转录好的Cas9mRNA和sgRNA混合均匀得到RNA混合物，将RNA混合物显微注射至小鼠受精卵的细胞质，随后将存活的受精卵植入雌性小鼠体内，繁殖获得F0代小鼠；提取F0代小鼠的基因组DNA，作为模板，进行PCR反应，产物经酶切，选择突变小鼠，从而确定Founder小鼠；Founder小鼠与野生型雄性小鼠交配获得F1代小鼠。本发明专利技术还提供了由该方法构建的动物模型以及该模型在研究粘多糖贮积症II型中的用途。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医学生物学
，具体地，本专利技术涉及一种动物模型的构建方法。
技术介绍
小鼠疾病模型在研究人类疾病致病机理和药物筛选中起到了关键作用，特别是在评价药物治疗效果及治疗方式的选择上具有重要价值。基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。这是一项复杂的分子生物学技术，又称为“基因打靶”技术，到目前为止，利用该技术已构建了数千种基因突变小鼠模型。然而这项传统的基因敲除方法因流程复杂、耗时长、费用大，近些年来，大家都在寻找一种更快速、更经济且适用性强的新方法。粘多糖贮积症II型(MucopolysaccharidosistypeII，MPSII，MIM309900)，又称Hunter综合征，是一种X连锁隐性遗传病，由于基因突变导致溶酶体酶艾杜糖-2-硫酸酯酶(iduronate-2-sulfatase，IDS)缺乏，以致粘多糖(mucop01ysaccharides，MPS)在体内大量沉积，尿中大量排出硫酸皮肤素(dermatinsulfateB，DS)、硫酸已酰肝素(heparitinsulfate，HS)。患者出生时表现一般正常，但随着越来越多的粘多糖贮积在体内，MPSII病程进行性加重，症状典型，预后甚差。IDS基因定位于Xq27.3-Xq28，MPSII与IDS基因发生突变高度相关。由于发病率极低，又被称为“孤儿病”。目前，世界上该疾病的研究及治疗仍比较困难。专利技术内容针对当前动物模型构建时存在的过程复杂、条件苛刻、费用巨大，以及当前粘多糖贮积症II型研究中缺少可研究的动物模型的问题，本专利技术提供了一种粘多糖贮积症II型动物模型的构建方法，由该方法获得的动物模型，以及该动物模型在研究粘多糖贮积症II型中的用途。第一方面，本专利技术提供了一种粘多糖贮积症II型动物模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)针对小鼠IDS基因设计靶点，合成寡核苷酸链，合成的寡核苷酸链经退火与pUC57-T7-sgRNA质粒进行连接，获得sgRNA表达载体；(2)获得小鼠受精卵；(3)将转录好的Cas9mRNA和sgRNA混合均匀得到RNA混合物，将RNA混合物显微注射至小鼠受精卵的细胞质，随后将存活的受精卵植入雌性小鼠体内，繁殖获得F0代小鼠；(4)提取F0代小鼠的基因组DNA，作为模板，采用包含sgRNA作用靶点的引物，进行PCR反应，产物经酶切，选择突变小鼠，从而确定Founder小鼠；(5)Founder小鼠与野生型雄性小鼠交配获得F1代小鼠。前述的构建方法，步骤(1)中合成如下两对寡核苷酸链：msIdsE5-1-sgRNA1：TAGGACAAAGCAGATTGGCG和AAACCGCCAATCTGCTTTGT；msIdsE5-2-sgRNA2：TAGGATGTGGCAGATGTGCCTGA和AAACTCAGGCACATCTGCCACAT。前述的构建方法，在步骤(2)中，以4-5周龄的雌性小鼠为供体，腹腔注射PMSG和hCG进行超数排卵，随后与雄性小鼠交配，次日获得小鼠受精卵。前述的构建方法，步骤(4)中，包含sgRNA作用靶点的引物是：msIdsE5C9正向引物：AGTTCTGGTCTGGAGACACAATT；msIdsE5C9反向引物：AGGCATCCTGGTAGGTAGGTTAT。前述的构建方法，步骤(4)中，PCR反应的体系是50μL，PCR反应的条件是：95℃预变性5min，随后95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，随后72℃延伸10min。前述的构建方法，步骤(4)中，采用T7核酸内切酶进行酶切。前述的构建方法，步骤(4)中，选择突变小鼠之后，先通过TA克隆、测序进一步检测确定突变，之后再确定Founder小鼠。前述的构建方法，还包括粘多糖贮积症II型动物模型的基因型鉴定，包括步骤：提取F1代小鼠的基因组DNA；设计包含sgRNA作用靶点的引物，并以提取的F1代小鼠的基因组DNA为模板，进行PCR反应，对PCR反应的产物进行测序。前述的构建方法，所述包含sgRNA作用靶点的引物是：msIdsE5C9正向引物：AGTTCTGGTCTGGAGACACAATT；msIdsE5C9反向引物：AGGCATCCTGGTAGGTAGGTTAT。前述的构建方法，所述PCR反应的反应体系是50μL，反应条件是：95℃预变性5min，随后95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，随后72℃延伸10min。前述的构建方法，还包括粘多糖贮积症II型动物模型的表型分析，包括步骤：分别提取F1代小鼠和雄性野生型小鼠的心脏、肝脏、脾脏和肾脏四种组织，制作成组织切片，对组织切片阿尔新蓝染色，并将F1代小鼠的组织切片与雄性野生型小鼠的组织切片进行比较。第二方面，本专利技术提供了第一方面的构建方法构建的粘多糖贮积症II型动物模型。前述的粘多糖贮积症II型动物模型，X染色体的艾杜糖-2-硫酸酯酶基因的核苷酸18956-18975bp缺失，其序列是AACTCCACGCCAATCTGCTT。第三方面，本专利技术提供了第一方面的构建方法构建的粘多糖贮积症II型动物模型或者第二方面的粘多糖贮积症II型动物模型在研究粘多糖贮积症II型中的用途。本专利技术的技术方案至少具有如下有益效果：(1)本专利技术基于CRISPR/Cas9基因敲除技术建立的粘多糖贮积症II型小鼠动物模型为进一步深入研究粘多糖贮积症II型的致病机理及治疗效果评价提供了极其重要的动物模型。(2)采用本专利技术的方法获得粘多糖贮积症II型小鼠动物模型的周期短，仅需2个月。(3)采用本专利技术获得的IDS基因敲除模型鼠，其基因型标记为X-idsXids，为表现型正常的小鼠，可在实验室中正常培养，通过与野生型C57BL/6雄性小鼠(基因型为XidsY)交配，其基因可稳定遗传，专利技术人成功建立了一种基因可稳定遗传的IDS基因敲除模型鼠品系。其与野生型C57BL/6雄性小鼠(基因型为XidsY)交配获得F1代小鼠，F1代小鼠中理论上有25％的小鼠其基因型为X-idsY，即粘多糖贮积症II型小鼠动物模型(基因型为X-idsY)，同时理论上有25％的小鼠的基因型为X-idsXids，即IDS基因敲除模型鼠(基因型为X-idsXids)。这种情况下，一旦获得IDS基因敲除模型鼠(基因型为X-idsXids)，就只需在实验室中进行简单的自然交配过程就会获得粘多糖贮积症II型小鼠动物模型(基因型为X-idsY)，而不需要再重新进行复杂的基因敲除实验。因此，本专利技术的方法获得了一种可同时生产IDS基因敲除模型鼠和粘多糖贮积症II型小鼠动物模型的IDS基因敲除模型鼠，这是本专利技术技术方案中的最巧妙之所在。附图说明图1为RNA介导的Cas9系统定向基因组修饰作用机制示意图；图2为CRISPR/Cas9介导的IDS基因修饰情况分析；图3为靶点处DNA序列结构示意图；图4(A)和图4(B)为粘多糖贮积症II型小鼠动物模型的基因型鉴定测序结果；图5为粘多糖贮积症II型小鼠动物模型组织切片阿尔本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种粘多糖贮积症II型动物模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)针对小鼠IDS基因设计靶点，合成寡核苷酸链，合成的寡核苷酸链经退火与pUC57‑T7‑sgRNA质粒进行连接，获得sgRNA表达载体；(2)获得小鼠受精卵；(3)将转录好的Cas9mRNA和sgRNA混合均匀得到RNA混合物，将RNA混合物显微注射至小鼠受精卵的细胞质，随后将存活的受精卵植入雌性小鼠体内，繁殖获得F0代小鼠；(4)提取F0代小鼠的基因组DNA，作为模板，采用包含sgRNA作用靶点的引物，进行PCR反应，产物经酶切，选择突变小鼠，从而确定Founder小鼠；(5)Founder小鼠与野生型雄性小鼠交配获得F1代小鼠。

【技术特征摘要】
1.一种粘多糖贮积症II型动物模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)针对小鼠IDS基因设计靶点，合成寡核苷酸链，合成的寡核苷酸链经退火与pUC57-T7-sgRNA质粒进行连接，获得sgRNA表达载体；(2)获得小鼠受精卵；(3)将转录好的Cas9mRNA和sgRNA混合均匀得到RNA混合物，将RNA混合物显微注射至小鼠受精卵的细胞质，随后将存活的受精卵植入雌性小鼠体内，繁殖获得F0代小鼠；(4)提取F0代小鼠的基因组DNA，作为模板，采用包含sgRNA作用靶点的引物，进行PCR反应，产物经酶切，选择突变小鼠，从而确定Founder小鼠；(5)Founder小鼠与野生型雄性小鼠交配获得F1代小鼠。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中合成如下两对寡核苷酸链：msIdsE5-1-sgRNA1：TAGGACAAAGCAGATTGGCG和AAACCGCCAATCTGCTTTGT；msIdsE5-2-sgRNA2：TAGGATGTGGCAGATGTGCCTGA和AAACTCAGGCACATCTGCCACAT。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在步骤(2)中，以4-5周龄的雌性小鼠为供体，腹腔注射PMSG和hCG进行超数排卵，随后与雄性小鼠交配，次日获得小鼠受精卵。4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)中，包含sgRNA作用靶点的引物是：msIdsE5C9正向引物：AGTTCTGGTCTGGAGACACAATT；msIdsE5C9反向引物：AGGCATCCTGGTAGGTAGGTTAT。5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)中，PCR反应的体系是50μL，PCR反应的条件是：95℃预变性5min，随后95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，随后72℃延伸10min。6.根据权利要求1所述的构建方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：高恩，侯增淼，李晓颖，李敏，杨小琳，赵金礼，
申请(专利权)人：陕西慧康生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：陕西;61