本发明专利技术公开了一种可稳定、高效表达人β-NGF的重组表达载体，含有该重组表达载体的重组真核细胞，以及一种生产重组人β-NGF的方法。本发明专利技术所述重组表达载体包含启动子、β球蛋白基因内含子、人β-NGF基因、内部核糖体进入位点序列和筛选标记基因，在宿主细胞中的整合、表达效率较高。含该重组表达载体的重组真核细胞表达与天然β-NGF活性相当的重组人β-NGF，且经多次传代后仍能稳定表达；所表达的β-NGF分泌到培养基中，易分离、纯化，大大降低了生产下游的难度和成本，具有很好的临床应用前景和商业价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种重组人β -NGF的分泌型表达载体以及含该载体的重组细胞株。
技术介绍
神经生长因子(NGF)是神经营养因子中最早被发现、目前研究最为透彻的一种神经细胞生长调节因子，具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能，它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。NGF在人体内主要分布于脑、神经节、虹膜、心脏、脾、胎盘等组织及成纤维细胞、平滑肌、骨骼肌、胶质细胞、雪旺氏细胞等。NGF与受体结合，通过受体介导的内吞机制产生内在化，形成由轴膜包绕、含有NGF、并保持其生物活性的小泡，经轴突沿微管逆行转运至胞体，经醋氨酸蛋白激酶、脂眈肌醇钙、内源性环腺昔酸等第二信使体系的转导，启动一系列级联反应，对靶细胞的某些结构或功能蛋白基因表达进行调控而发挥其生物效应。大鼠体内试验结果表明:NGF可改善由己二酮和丙烯胺造成的大鼠中毒性周围神经病所致的肢体运动功能障碍，缩短神经-肌肉动作电位潜伏期，并提高神经-肌肉动作电位幅度。组织病理学检查结果表明，NGF有减轻动物胫神经的髓鞘肿胀发生率和降低变性胫神经纤维数量等作用。以上结果提示=NGF有促进神经损伤修复的作用。NGF包含α、β、Y三个亚基，活性区是β亚基，由两个118个氨基酸组成的单链通过非共价键结合而成的二聚体。NGF0亚基(简称β-NGF)具有完整的NGF生物学活性，是与BDNF，ΝΤ-3和ΝΤ-4结构相关的神经营`养因子，为含有半胱氨酸结(cysteineknot)的稳定二聚体结构家族。β-NGF是一种强效的`神经营养因子，通过其受体β-NGFR进行信号传递，在外周神经中知觉神经元和交感神经系统的发育中起到重要的作用。β-NGF还在B淋巴细胞中起到生长和分化因子的作用，可以增强B细胞的存活能力，抑制中性粒细胞的凋亡。上述研究结果提示，β-NGF是一种多功能的细胞因子，不仅在神经系统发育中起重要作用，在免疫调节中可能也具有重要的作用。目前生产β-NGF的方法主要有两种:一种是从小鼠颌下腺提取的分子量约为13-14KD，沉降系数为2.5S的β -NGF，此种方式所获得的β -NGF具有如下缺点:(I)鼠NGF与人NGF在蛋白序列上有10%的差异，使其具有免疫原性，可能诱发抗体反应，从而降低药效；(2)具有鼠源病毒交叉感染的安全隐患；(3)生产依赖活体动物。另一种是由原核表达系统(E.coli)重组表达制备，此种方式的缺陷是，蛋白不能进行翻译后修饰，所得β-NGF活性明显低于天然β-NGF。因此，开发一种可稳定、高效表达天然活性β-NGF的表达系统具有重要的临床及商业价值。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题为提供一种可稳定、高效表达天然活性β -NGF的重组表达载体，基于该重组表达载体的重组真核细胞株，以及基于该重组真核细胞株的生产人β-NGF的方法。具体地，本专利技术提供了一种表达人β -NGF(即人神经生长因子β亚基)的重组表达载体，依次包含以下可操作性相连的元件:启动子、β球蛋白基因内含子、人β-NGF基因、内部核糖体进入位点序列和筛选标记基因；所述β球蛋白基因内含子序列如SEQ ID N0.1所示，人β -NGF基因序列如SEQ ID N0.2所示，内部核糖体进入位点序列如SEQ ID N0.3所示。上述重组表达载体中，所述启动子驱动人β-NGF基因和筛选标记基因的共表达；所述β球蛋白基因内含子，简称BGI，可增强人β-NGF基因的转录效率，还可促进mRNA从细胞核转移到内质网；所述内部核糖体进入位点，简称IRES，可招募核糖体对mRNA进行翻译，因此可调控其下游筛选标记基因的表达。优选地，所述启动子为CMV启动子、PGK启动子、RSV启动子或SV40启动子中的任意一种。所述筛选标记基因为二氢叶酸还原酶基因、谷氨酰胺合成酶基因、新霉素抗性基因、博来霉素抗性基因、潮霉素抗性基因或多色霉素抗性基因中的任意一种。上述重组表达载体适用的起始构建载体不限，如在哺乳动物细胞中表达用的疫苗病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体或腺伴病毒载体。本专利技术的另一个目的在于提供一种重组真核细胞，所述真核细胞包含上述重组表达载体；或者所述真核细胞的基因组中整合有以下可操作性相连的元件:启动子、β球蛋白基因内含子、人β-NGF基因、内部核糖体进入位点序列和筛选标记基因；所述β球蛋白基因内含子序列如SEQ ID N0.1所示，人β -NGF基因序列如SEQ ID N0.2所示，内部核糖体进入位点序列如SEQ ID N0.3所示。 上述重组真核细胞中，所述真核细胞为人ΝΙΗ293细胞、中国仓鼠CHO细胞、COS细胞或MDCK细胞。所述启动子为CMV启动子、PGK启动子、RSV启动子或SV40启动子中的任意一种。所述筛选标记基因为二氢叶酸还原酶基因、谷氨酰胺合成酶基因、新霉素抗性基因、博来霉素抗性基因、潮霉素抗性基因或多色霉素抗性基因中的任意一种。本专利技术还提供了一种生产重组人β -NGF的方法，包括如下步骤:(I)将上述重组表达载体转染真核细胞；(2)筛选含有上述重组表达载体的细胞或整合有以下可操作性相连的元件:启动子、β球蛋白基因内含子、人β-NGF基因、内部核糖体进入位点序列和筛选标记基因的细胞，并进行培养；(3)收集培养基并纯化细胞分泌出的人β -NGF。本专利技术所提供的人β-NGF重组表达载体，与宿主细胞基因组的整合效率较高，包含该重组表达载体的重组细胞株分泌表达β -NGF蛋白的效率也较高，其分泌效率大于20pg/细胞/天；另外，本专利技术重组表达载体采用一个启动子同时诱导β -NGF基因和筛选标记基因转录、并使用IRES启动后者翻译的方式，使得细胞耐药性和表达量高度统一，因此，当使用该重组表达载体转染宿主细胞时，筛选出阳性表达细胞株的概率较大，所得重组表达细胞株在筛选条件下可持续、稳定表达β -NGF蛋白一细胞系经多次传代后，仍能高效表达β-NGF蛋白。附图说明图1为重组质粒pCMV- β -NGF的结构示意图；图2为重组质粒pCMV- β -NGF-1RES-dhfr的结构示意图；图3为本专利技术β -NGF重组细胞株适应无血清培养基培养所分泌的β -NGF的SDS-PAGE电泳图，β -NGF条带在大约13KD的位置；图4为本专利技术β -NGF重组细胞株所分泌的β -NGF的部分质谱肽图；A、B、C、D、E、F分别为六段与理论序列相匹配的肽段的质谱图；图5为本专利技术β -NGF重组细胞株所分泌的β -NGF诱导PC12细胞分化结果图；低浓度是指β-NGF含量为10ng/ml，高浓度是指β-NGF含量为100ng/ml ；图6为本专利技术β -NGF重组细胞株所分泌的β -NGF与市售鼠源β -NGF诱导PC12细胞分化的剂量-反应曲线；纵坐标为阳性细胞簇所占百分比，横坐标为β -NGF的浓度；图7为SDS-PAGE&考马斯亮蓝染色检测10株本专利技术β -NGF重组细胞株的β -NGF产量；以系列浓度的BSA条带为参照；图8为SDS-PAGE&考马斯亮蓝染色检测本专利技术β -NGF重组细胞株传代30、40、50、60次后的β -NGF分泌情况；Ρ30、Ρ40、Ρ50、Ρ60分别代表重组细胞传代30、40、50、6本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种表达人β?NGF的重组表达载体，其特征在于，依次包含以下可操作性相连的元件：启动子、β球蛋白基因内含子、人β?NGF基因、内部核糖体进入位点序列和筛选标记基因；所述β球蛋白基因内含子序列如SEQ?ID?No.1所示，人β?NGF基因序列如SEQ?ID?No.2所示，内部核糖体进入位点序列如SEQ?ID?No.3所示。
【技术特征摘要】
1.一种表达人β-NGF的重组表达载体，其特征在于，依次包含以下可操作性相连的元件:启动子、β球蛋白基因内含子、人β-NGF基因、内部核糖体进入位点序列和筛选标记基因；所述β球蛋白基因内含子序列如SEQ ID N0.1所示，人β-NGF基因序列如SEQ IDN0.2所示，内部核糖体进入位点序列如SEQ ID N0.3所示。2.如权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述启动子为CMV启动子、PGK启动子、RSV启动子或SV40启动子中的任意一种。3.如权利要求1或2所述的重组表达载体，其特征在于，所述筛选标记基因为二氢叶酸还原酶基因、新霉素抗性基因、博来霉素抗性基因或潮霉素抗性基因。4.一种重组真核细胞，其特征在于，所述真核细胞含有权利要求1所述的重组表达载体；或者所述真核细胞的基因组中整合有以下可操作性相连的元件:启动子、β球蛋白基因内含子、人β-NGF基因、内部核糖体进入位点序列和筛选标记基因；所述β球蛋白基因内含子序列如SEQ ID N0.1所示，人β -N...
【专利技术属性】
技术研发人员：薛博夫，马墨，丽贝卡·梅尔本，朱林，
申请(专利权)人：薛博夫，
类型：发明
国别省市：
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