本发明专利技术公开一种生产α‑亚麻酸的圆红冬孢酵母及其制备方法。本发明专利技术通过从多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)胞内克隆得到活性较高的Δ15脱饱和酶基因，连接至经过改造的植物双元表达载体pCAMBIA1300，转化到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens LBA4404)胞内并通过共培养将Δ15脱饱和酶基因结合至圆红冬孢酵母的基因组上，实现多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶在圆红冬孢酵母胞内的过表达，从而增加α‑亚麻酸在圆红冬孢酵母胞内的产量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及α-亚麻酸的生产领域，尤其涉及一种生产α-亚麻酸的圆红冬孢酵母及其制备方法和生产α-亚麻酸的方法。
技术介绍
α-亚麻酸(cisΔ9,12,15，英文缩写ALA)属于ω-3系列多不饱和脂肪酸，为全顺式9,12,15-十八碳三烯酸，它在人体内不能合成，必须从体外食物中获取，多以不饱和甘油酯的形式存在于亚麻籽、沙棘籽、大豆等植物中。α-亚麻酸在人体内通过一系列的碳链延长和脱饱和反应能够被转化为机体必需的二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，然而，α-亚麻酸比EPA和DHA的作用更好并且更安全，它是构成人体组织细胞的主要成分，如果人体缺乏，便会引起机体脂质体代谢紊乱，会直接导致疲劳、健忘、视力减退、免疫力下降、动脉粥样硬化等症状的发生。目前国内外已有明确报道：如果婴幼儿童或青少年缺乏α-亚麻酸，会严重影响智力的正常发育。美国国家食品药品监督管理局的研究证明，缺乏α-亚麻酸将导致儿童大脑及视网膜发育迟缓，营养吸收不均衡或者不能被有效吸收，同时会导致注意力不集中和智力发育迟缓、弱视、多动症、肥胖、厌食以及免疫力低下等多种症状和疾病。成年人缺乏α-亚麻酸，体内的维生素、矿物质、氨基酸、蛋白质等物质不能被有效吸收和利用，甚至会出现代谢紊乱症状。从自然界植物中提取α-亚麻酸的成本高且产率低，不适合工业化生产的需求。近年来利用微生物生产多不饱和脂肪酸成为研究热
点。利用微生物生产多不饱和脂肪酸具有简单、过程可控、易放大、不受天气环境影响等优点。圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)是自然界中为数不多的可以合成多不饱和脂肪酸的酵母，这种产油酵母具有营养需求简单、易进行放大和高密度培养、遗传背景比较清楚等优势。圆红冬孢酵母胞内可以合成并积累α-亚麻酸，然而产量并不高，因而强化圆红冬孢酵母生产α-亚麻酸具有重要的研究和应用价值。目前利用培养和发酵优化的方法对于增加圆红冬孢酵母生产α-亚麻酸的效果并不理想，所以必须从基因水平强化圆红冬孢酵母胞内α-亚麻酸的代谢途径，进而达到增加α-亚麻酸产量的目的。然而，圆红冬孢酵母属于粘红酵母菌，对于这类酵母的遗传操作方法比较有限。另外，α-亚麻酸在圆红冬孢酵母胞内的合成途径是先由硬脂酸经过Δ9脱饱和酶(FAD9)催化生成油酸；再由Δ12脱饱和酶(FAD12)催化油酸生成亚油酸；最后经过Δ15脱饱和酶(FAD15)催化生成α-亚麻酸。在这条合成途径中Δ15脱饱和酶是主要的限速酶，正是由于圆红冬胞酵母胞内Δ15脱饱和酶的低活性限制了α-亚麻酸的产量。但是如何增强Δ15脱饱和酶的活性，强化从亚油酸到α-亚麻酸的合成途径，进而增加圆红冬胞酵母合成α-亚麻酸的产量是长期以来一直面临的重要难题。
技术实现思路
为了克服现有技术无法大幅度提高圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides ACCC 20341)生产α-亚麻酸的问题，本申请的专利技术人发现，从多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)胞内克隆得到的Δ15脱饱和酶基因在圆红冬孢酵母表达时显示出高活性，将其连接至植物双元表达载体pCAMBIA1300，转化到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens LBA4404)胞内，并通过共培养将Δ15
脱饱和酶基因转化至圆红冬孢酵母，实现具有高活性的多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶在圆红冬孢酵母胞内的过表达，从而能够强化圆红冬孢酵母生产α-亚麻酸的能力。具体地，本专利技术提供以下内容。本专利技术的一方面，提供一种圆红冬孢酵母菌株，其包含多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶基因表达元件。在一个优选实施方案中，多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶基因表达元件包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。在另一优选实施方案中，本专利技术的圆红冬孢酵母菌株能够过表达具有高活性的多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶。在另一优选实施方案中，本专利技术的圆红冬孢酵母菌株具有强化α-亚麻酸生产的能力。本专利技术的另一方面，提供一种圆红冬孢酵母菌株的制备方法，其包括：将表达多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶的基因或其片段引入圆红冬孢酵母菌株，从而强化所述圆红冬孢酵母菌株的α-亚麻酸生产能力。优选地，所述表达多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶的基因具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。在一个优选的实施方案中，圆红冬孢酵母菌株的制备方法包括：Δ15脱饱和酶基因表达载体pCAMBIA-FAD15的构建，其中所述pCAMBIA-FAD15包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；利用所述pCAMBIA-FAD15质粒转化根癌农杆菌；将所述转化的根癌农杆菌与所述圆红冬孢酵母共培养，从而将Δ15脱饱和酶基因转化至所述圆红冬孢酵母的基因组。优选地，所述pCAMBIA-FAD15进一步包含潮霉素抗性基因(HYGR)表达元件。优选地，所述潮霉素抗性基因表达元件由GPD基因的启动子、潮霉素抗性基因和CaMV终止子组成。优选地，所述潮霉素抗性基因具SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。本专利技术的再一方面，提供一种生产α-亚麻酸的方法，其包括培养本专利技术所述的圆红冬孢酵母菌株的步骤。在优选地实施方案中，生产α-亚麻酸的方法包括以下步骤：1)利用YEPD培养基培养活化的圆红冬孢酵母菌株；2)收集步骤1)培养而得到的圆红冬孢酵母菌株，接种至补料发酵培养基进行补料发酵，所述补料发酵培养基含有碳源、氮源和无机盐，补料发酵过程中，总碳氮比始终维持在100:0.7～1.5。活化的圆红冬孢酵母菌株可以直接采用活化状态的菌株，也可由保藏状态的菌株活化而来。所述YEPD培养基或称为YPD培养基，即，酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)，按照常规配方配置即可。优选地，按照如下配方配置：8～12g/L酵母粉，8～20g/L蛋白胨，15～25g/L葡萄糖，pH为5.8～6.0。若制固体培养基，加入10～20g/L琼脂粉,优选为15g/L琼脂粉。在本专利技术的一个优选实施方式中，YEPD培养基按照如下配方配置：10g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，pH＝5.8～6.0。步骤1)和步骤2)可以在发酵罐中进行。步骤2)中，补料发酵是指，通过补料流加所述碳源维持所需的碳氮比。根据本专利技术所述的生产α-亚麻酸的方法，优选地，步骤2)中，所述碳源为含有葡萄糖和木糖的混合碳源，所述氮源为谷氨酸钠或蛋白胨，所述无机盐含有钾元素、镁元素和磷元素。根据本专利技术所述的生产α-亚麻酸的方法，优选地，步骤2)中，碳源为含有15～25g/L葡萄糖和25～35g/L木糖的混合碳源，氮源为5.8～6.5g/L的谷氨酸钠或4.6～5.5g/L的蛋白胨，所述无机盐包括0.3～0.7wt％的KH2PO4、0.1～0.3wt％的K2HPO4和0.3～0.7wt％的MgCl2。以上各成分的含量是指各成分在补料发酵培养基中的含量。
补料发酵过程中，通过流加所述碳源的水溶液(即，通过流加含有15～25g/L的葡萄糖和25～35g/L的木糖的混合本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种圆红冬孢酵母菌株，其包含多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶基因表达元件。
【技术特征摘要】
1.一种圆红冬孢酵母菌株，其包含多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶基因表达元件。2.根据权利要求1所述的圆红冬孢酵母菌株，其中所述多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶基因表达元件包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。3.根据权利要求1或2所述的圆红冬孢酵母菌株，其中所述圆红冬孢酵母菌株过表达具有活性的多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶。4.根据权利要求1或2所述的圆红冬孢酵母菌株，其中所述圆红冬孢酵母菌株具有强化α-亚麻酸生产的能力。5.一种圆红冬孢酵母菌株的制备方法，其包括：将SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列引入圆红冬孢酵母菌株，从而使所述圆红冬孢酵母菌株过表达具有活性的多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶。6.根据权利要求5所述的方法，其包括：Δ15脱饱和酶基因表达载体的构建，其中所述表达载体包含SEQ ID NO:1、SE...
【专利技术属性】
技术研发人员：祁峰，黄建忠，张明亮，孙磊，江贤章，邹丽梅，
申请(专利权)人：福建师范大学，
类型：发明
国别省市：福建;35
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