本发明专利技术提供了一种低产高级醇高产乳酸乙酯酿酒酵母菌株及其构建方法，包括目的基因的获得，染色体整合载体的构建和选育菌株发酵验证。选育的酵母菌株对南极假丝酵母(Pseudozyma antarctica)脂肪酶B进行异源分泌表达，与亲本菌株相比：所构建的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株基本发酵性能不受影响，高粱原料半固态白酒发酵6天后，选育菌株乳酸乙酯含量提高了57.4％‑84.5％；高级醇生成量显著降低，分别为：异戊醇降低了9.5％，异丁醇降低了约50.0％，活性戊醇降低了约44.0％。选育的酿酒酵母菌株显著提高乳酸乙酯生成量的同时降低高级醇生成量，在一定程度上解决了酒类风味物质不协调等问题，在白酒相关领域有广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
，涉及工业微生物的育种，尤其是一种低产高级醇高产乳酸乙酯的酿酒酵母菌株及其构建方法。
技术介绍
白酒中的微量风味物质是影响白酒品质的主要因素，含量约占1％-2％，其中酯类物质又占微量成分的60％-90％，因此提高白酒的酯含量对于形成白酒风味典型性具有非常重要的意义。高含量酯能够使得酒体柔和，香味协调，改善饮料酒的品质。清香型白酒酯类化合物中乳酸乙酯仅次于乙酸乙酯，乳酸乙酯和乙酸乙酯的含量及比例对白酒的风味影响很大。而对于老白干香型白酒来说，乳酸乙酯含量要多于乙酸乙酯，其比例为1.5-2.2∶1，GB/T20825规定，老白干香型白酒乳酸乙酯/乙酸乙酯≥0.80，因此乳酸乙酯含量对于对固态清香型白酒具有非常重要的意义。由于现代大型白酒企业卫生条件控制严格，新厂建立等，使得白酒中乳酸乙酯生成量较低，尤其是冬季，乳酸乙酯生成量更少，严重影响白酒风味，造成酒香不突出，后味淡薄。工业上为了增香通常会加入产酯酵母，这对乳酸乙酯的生成量几乎没有作用，另一方面通过延长发酵时间和窖藏陈酿时间提高酯香物质不仅增加耗粮，还会带来糠嗅味、涩味、酸味等异味物质影响白酒品质。同时高级醇作为酒类重要的助香物质，含量过高，使酒产生令人不愉快的异杂味，影响酒的风味和品质。此外高级醇在人体内的代谢速度远低于乙醇，对人体的毒害作用更大。如何提高饮料酒中酯香物质的含量，能否让酿酒酵母大量酯化乳酸和乙醇合成乳酸乙酯，是一个困扰我国现代大型饮料酒业界和相关科研单位的问题。目前提高普通白酒乳酸乙酯含量的主要方法有如下三种：一是全液法，在发酵醪中加入产香微生物，乳酸菌发酵液或将乳酸发酵液经化学，生物法酯化后，再加到发酵醪中。二是调香法，用天然香料调制或用纯化学药品按某一名酒的香味成分组成来进行调香；三是固液结合法，用液态法生产酒基，用固态法的酒糟、酒尾或成品酒来提高质量；这些提高酒中乳酸乙酯含量的方法大多是从工艺水平上进行的，虽然酯香物质含量有一定提高，但酒质与高档名酒相差仍很大，特别是化学品的添加存在安全隐患。而通过延长发酵时间和窖藏陈酿时间提高酯香物质不仅增加耗粮，还会带来糠嗅味、涩味、酸味等异味物质对白酒品质的影响。对于降低白酒高级醇含量，一般通过改变发酵工艺条件，如发酵温度、时间及工艺方法等，但降低较高不显著，发酵性能不稳定。以上提高酯类物质的方法均以改变发酵工艺为切入点，不仅收效甚微，甚至存在安全隐患。选育高产乳酸乙酯低产高级醇酿酒酵母菌株，通过改变酵母相关代谢途径，能够有效解决乳酸乙酯生成量低高级醇生成量较高的问题。白酒中酯类的生成途径有两种：一种是通过有机反应生成酯，在常温条件下极为缓慢，往往需要经几年时间才能使酯化反应达平衡；另一种就是由微生物的生化反应生成酯，这是白酒生产中产酯的主要途径。存在于酒中的汉逊酵母、假丝酵母等微生物，均有较强的产酯能力。近年来已有关于南极假丝酵母脂肪酶B合成短链酯类的相关研究。孙海龙等研究了表面展示处理后的南极假丝酵母脂肪酶B对丢糟中有机酸酯化效果的影响，酒样品乙酸乙酯和乳酸乙酯含量均有了很大提高。但目前国内酒类生产的相关研究中，并没有将南极假丝酵母脂肪酶B基因异源整合到酿酒酵母细胞中以提高乳酸乙酯生成量的相关报道。酿酒酵母酒精发酵过程中，25％的高级醇来源于Ehrlich途径，代谢途径中的BAT2基因编码的支链氨基酸转氨酶能够将相关氨基酸分解为高级醇前体物α-酮酸。因此通过选育BAT2基因缺失的酵母菌株，降低α-酮酸生成量可达到降低酿酒酵母高级醇生成量的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决酿酒酵母在酒类生产中合成乳酸乙酯能力较低以及高级醇含量较高的问题，提供一种低产高级醇高产乳酸乙酯的酿酒酵母菌株及其构建方法。为解决上述技术问题，本专利技术技术方案如下：本专利技术提供三株含分泌信号肽低产高级醇高产乳酸乙酯酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株，命名为α5CALBi、α5CALBn和α5CALBα。选择的分泌信号肽分别为酿酒酵母α接合因子信号肽MFα1，菊粉酶信号肽CSS和南极假丝酵母脂肪酶B信号肽nsB。高粱原料半固态白酒发酵6天后，α5CALBi乳酸乙酯含量提高了84.5％、α5CALBn提高了74.7％、α5CALBα提高了57.38％；高级醇生成量降低显著，分别为：异戊醇降低了9.5％，异丁醇降低了约50.0％，活性戊醇降低了约44.0％。本专利技术所述低产高级醇高产乳酸乙酯酵母菌株的构建方法，是通过用强启动子异源分泌表达南极假丝酵母脂肪酶B基因，并同时敲除细胞质支链氨基酸转氨酶基因来实现。所述异源表达南极假丝酵母脂肪酶B基因替换细胞质支链氨基酸转氨酶基因。所述细胞质支链氨基酸转氨酶基因为BAT2，其Gene ID为：853613，核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ NO：1所示；所述异源表达南极假丝酵母脂肪酶B基因为CALB，其Gene ID为：515792，核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ NO：2所示。所述出发酵母菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32315。本专利技术低产高级醇高产乳酸乙酯酵母菌株的构建方法具体包括如下步骤：1)将通过PCR方法获得到来源于华南理工大学赠予的质粒pMD20-T-CALB-2上的CALB基因片段连到质粒Yep-PGK上，得到三种质粒Yep-PGK-CALB(目的片段含有三种分泌信号肽序列)；2)使用PCR方法获得来源于酿酒酵母CICC32315支链氨基酸转氨酶基因BAT2上下同源臂BA、BB；3)使用PCR方法获得来源于三种质粒Yep-PC上的目的片段PGKp-CALBi-PGKT、PGKp-CALBn-PGKT和PGKp-CALBα-PGKT；以及来源于质粒pUG6上的抗性基因KanMX；4)使用融合PCR方法将三种目的片段PGKp-CALB-PGKT和BA融合得到BA-PGK-CALB片段，连接到质粒pUC19后得到质粒pUC-BAPCi、pUC-BAPCn和pUC-BAPCα；5)使用融合PCR方法将片段KanMX与BB融合得到片段KanMX-BB片段，连接三种质粒pUC-BAPC后得到pUC-BABPCiK、pUC-BABPCnK和pUC-BABPCαK；6)制备出发酵母菌株CICC32315的单倍体，筛选出各项发酵性能综合最优的a型和α型单倍体，并以α型单倍体作为出发菌株进行以下步骤操作。7)将通过PCR方法获得的来源于构建的三种质粒pUC-BABPCK的重组盒BA-PGK-CALBi-KanMX-BB、BA-PGK-CALBn-KanMX-BB和BA-PGK-CALBα-KanMX-BB，用醋酸锂转化法分别将其重组入酿酒酵母CICC32315α型单倍体，同源重组后得到酿酒酵母基因菌株。高粱原料半固态白酒发酵：称取78g高粱，加入200mL 60-70℃热水，静置20min后加入液化酶85～90℃浸泡1h，充分吸水液化，115℃蒸煮20min，降温至60℃，加糖化酶水浴保温30min，静置降温到30℃后加入大曲12g和接种2％乳酸菌，培菌12h后，按500万/mL接菌量接种α5CALB酵母菌株，30℃培养发酵。GC分析：发酵液经蒸馏后，酒样进行气相色谱分本文档来自技高网...
【技术保护点】
选育出的低产高级醇高产乳酸乙酯酿酒酵母菌株，是在酿酒酵母出发菌株中完全敲除支链氨基酸转氨酶编码基因BAT2同时分泌表达南极假丝酵母(Pseudozyma antarctica)脂肪酶B编码基因CALB获得的。
【技术特征摘要】
1.选育出的低产高级醇高产乳酸乙酯酿酒酵母菌株，是在酿酒酵母出发菌株中完全敲除支链氨基酸转氨酶编码基因BAT2同时分泌表达南极假丝酵母(Pseudozyma antarctica)脂肪酶B编码基因CALB获得的。2.如权利要求1所述的低产高级醇高产乳酸乙酯酿酒酵母菌株，其特征在于，所述出发菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32315。3.如权利要求1所述的低产高级醇高产乳酸乙酯酿酒酵母菌株，其特征在于，所述酿酒酵母菌株为异源分泌表达。4.如权利要求1所述的低产高级醇高产乳酸乙酯酿酒酵母菌株，其特征在于，所述BAT2基因其Gene ID为：85361...
【专利技术属性】
技术研发人员：张翠英，肖冬光，刘芳志，刘鑫，郭学武，陈叶福，杜丽平，董健，马立娟，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
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