本发明专利技术涉及一种酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌为以酿酒酵母株系WAT11为基础，基因组中整合了LUP基因表达框和BPLO基因的表达框，所述酿酒酵母工程菌优选被敲除了GAL80基因。本发明专利技术还涉及构建所述酵母工程菌的方法，以及使用所述酵母工程菌生产白桦脂酸的方法。通过本发明专利技术，可使用酿酒酵母，通过微生物发酵的方式来生产白桦脂酸，操作简单，产量高，生产周期短，占地小。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物的遗传改造，更特别地，涉及一种生产白桦脂酸的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工程菌及其构建方法。
技术介绍
白桦脂酸(Betulinic acid，BA)，又称桦木酸，是一种五环三萜类化合物。五环三萜类化合物是一类非常重要的植物次生代谢产物，这类化合物通常具有十分广泛的药理作用和生物活性。这类化合物广泛存在于植物界中，而且包含的类型数目较多，主要的五环三萜化合物有齐墩果烷型，乌苏烷型，羽扇豆烷型和木栓烷型几种类型，而白桦脂酸是羽扇豆烷型五环类三萜化合物的典型代表。近年来的大量研究表明，白桦脂酸有着显著的药理作用和生物活性，主要体现在抗肿瘤、抗HIV、抗炎、抗菌以及抗疟疾等方面的作用。白桦脂酸表现出的以上生物活性(特别是对人类黑色素瘤细胞的选择性杀伤作用以及抗HIV-1型感染的抑制作用)加上其作用机制特异以及较高的安全性等特点，使其成为非常具有研究价值的天然产物，具有十分广泛的应用开发前景。目前白桦脂酸的主要来源是从白桦树的树皮中直接提取与纯化，存在着资源浪费严重的问题。通过生物工程的方法，以微生物为生物容器来合成这类化合物具有广阔的前景。酿酒酵母是第一个基因组完成测序的真核生物，被作为真核模式生物，其表达调控机理比较明确并且具有遗传操作简单、繁殖速度快、安全可靠等特点，常被用作大规模生物发酵的真核表达菌株。酿酒酵母菌株WAT11是
实验室常用的酿酒酵母菌株，是在野生型株系W303中整合了拟南芥还原酶基因ATR1而来(Urban P,Mignotte C,Kazmaier M,et al.Cloning,yeastexpression,and characterization of the coupling of two distantly relatedArabidopsis thaliana NADPH-cytochrome P450reductases with P450CYP73A5[J].Journal of Biological Chemistry,1997,272(31):19176-19186)。白桦脂酸是通过三萜类共同前体物质2,3-氧化鲨烯经过羽扇豆醇合酶以及C-28位单加氧的P450分子的作用生成。WAT11自身能产生三萜类物质合成的前体物质2、3-氧化鲨烯，而且具有P450分子作用所需的还原酶。因此，专利技术人期望以WAT11为基础，通过分子生物学手段和遗传工程技术，构建一种生产白桦脂酸酿酒酵母工程菌。
技术实现思路
为解决以上技术问题，本专利技术提供了一种酿酒酵母工程菌，所述酿酒酵母工程菌为以酿酒酵母株系WAT11为基础，基因组中整合了LUP基因表达框和BPLO基因表达框，其中所述LUP基因表达框由LUP基因有效连接于第一可诱导启动子而形成，所述LUP基因的序列如SEQ ID NO:1所示，所述BPLO基因表达框由BPLO基因有效连接于第二可诱导启动子而形成，所述BPLO基因的序列如SEQ ID NO:2所示。这里的有效连接是指基因位于启动子的下游并由启动子控制转录。优选地，所述第一可诱导启动子为GAL1启动子，序列如SEQ ID NO:3所示。优选地，所述第二可诱导启动子为GAL10启动子，序列如SEQ ID NO:4所示。优选地，所述工程菌的GAL80基因被部分或全部敲除，所述GAL80基因的序列如SEQ ID NO:16所示。本专利技术还提供了一种构建酿酒酵母工程菌的构建方法，包括以下步骤：1)将LUP基因顺着GAL1启动子的方向插入到PESC-Trp载体的GAL1启动子的下游，使所述LUP基因处于所述GAL1启动子的控制下，并且将BPLO基因顺着GAL10启动子的方向插入到所述PESC-Trp载体的GAL10启动子的下游，使所述BPLO基因处于所述GAL10启动子的控制下，从而得到集成了LUP基因表达框和BPLO基因表达框的质粒PESC-TRP-LUP-BPLO，其中所述LUP基因的序列如SEQ ID NO:1所示，所述GAL1启动子的序列如SEQ ID NO:3所示，所述BPLO基因的序列如SEQID NO:2所示，所述GAL10启动子的序列如SEQ ID NO:4所示；2)通过定点突变的方法将所述质粒PESC-TRP-LUP-BPLO中所述LUP基因中GATATC中的胞嘧啶突变为胸腺嘧啶；3)用EcoRV酶切步骤2)中得到的突变的质粒PESC-TRP-LUP-BPLO，使其线性化，然后将所述线性化的质粒PESC-TRP-LUP-BPLO转入酿酒酵母WAT11中，通过酵母菌体内自动发生的同源重组使所述LUP基缺失了因表达框和所述BPLO基因表达框整合至所述酵母菌的基因组中；4)将由以5’至3’方向排列的GAL80基因5’区序列+loxP-KanMX-loxP+GAL80基因3’区序列组成的GAL80基因敲除框转化至步骤3)中得到的基因组中整合了所述LUP基因表达框和所述BPLO基因表达框的酿酒酵母中，通过细胞内自动发生的同源重组使所述酿酒酵母中的GAL80基因的相应位置被所述GAL80基因敲除框替换，所述GAL80基因敲除框的序列如SEQ ID NO:5所示；5)将Cre重组酶转化至步骤4)得到的GAL80基因被敲除的酿酒酵母中，使所述片段再次发生重组，丢失所述loxP-KanMX-loxP片段，从而得到具有所述LUP基因表达框和所述BPLO基因表达框并且缺失了所述Gal 80基因编码框的酿酒酵母工程菌。本专利技术还提供了一种生产白桦脂酸的方法，包括以下步骤：1)培养上述酿酒酵母工程菌至对数期；2)诱导步骤1)所培养的所述酿酒酵母工程菌；3)从步骤2)中被诱导的所述酿酒酵母工程菌培养物提取白桦脂酸。优选地，步骤1)中使用加有葡萄糖的SD-Trp-液体培养基培养所述酿酒酵母工程菌。优选地，步骤2)中使用加有半乳糖的SD-Trp-液体培养基培养所述酿酒酵母工程菌以诱导所述酿酒酵母工程菌产生白桦脂酸。优选地，所述方法包括以下步骤：1)将所述酿酒酵母工程菌接种于加有2％葡萄糖的SD-Trp-液体培养基中，置于30℃，250rpm/min培养16小时；2)收集菌体，用无菌水洗涤，重悬于加有2％半乳糖的SD-Trp-培养基中至起始OD600值为0.8，置于30℃，250rpm/min下诱导培养7天；3)用2M HCl将步骤2)中得到的酵母培养物调至PH2.0，用等体积的乙酸乙酯抽提3次，合并这3次的乙酸乙酯相，吹干；4)将步骤3)中吹干后用少量乙酸乙酯复溶，转入2ml离心管，吹干，即得到白桦脂酸。附图说明图1为质粒PESC-TRP-LUP-BPLO的图谱；图2为酵母整合YIPlac204-LUP-BPLO的图谱；图3为PCR产物的电泳照片，其中泳道1和3分别是以酿酒酵母株系WAT11(泳道3)和WAT11-LUP-BPLO(泳道1)为模板，扩增LUP基因的PCR产物电泳照片，泳道2和4分别是以酿酒酵母株系WAT11(泳道4)和WAT11-LUP-BPLO(泳道2)为模板，扩增BPLO基因的PCR产物电泳照片；图4为PCR产物的电泳照片，该PCR以酿酒酵母株系W80(泳道1)和WAT11-LUP-BPLO(泳道2)的基因组为模板本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌为以酿酒酵母株系WAT11为基础，基因组中整合了LUP基因表达框和BPLO基因表达框，其中所述LUP基因表达框由LUP基因有效连接于第一可诱导启动子而形成，所述LUP基因的序列如SEQ ID NO:1所示，所述BPLO基因表达框由BPLO基因有效连接于第二可诱导启动子而形成，所述BPLO基因的序列如SEQ ID NO:2所示。
【技术特征摘要】
1.一种酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌为以酿酒酵母株系WAT11为基础，基因组中整合了LUP基因表达框和BPLO基因表达框，其中所述LUP基因表达框由LUP基因有效连接于第一可诱导启动子而形成，所述LUP基因的序列如SEQ ID NO:1所示，所述BPLO基因表达框由BPLO基因有效连接于第二可诱导启动子而形成，所述BPLO基因的序列如SEQ ID NO:2所示。2.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述第一可诱导启动子为GAL1启动子，序列如SEQ ID NO:3所示。3.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述第二可诱导启动子为GAL10启动子，序列如SEQ ID NO:4所示。4.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述工程菌的GAL80基因被部分或全部敲除，所述GAL80基因的序列如SEQ ID NO:16所示。5.一种构建酿酒酵母工程菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将LUP基因顺着GAL1启动子的方向插入到PESC-Trp载体的GAL1启动子的下游，使所述LUP基因处于所述GAL1启动子的控制下，并且将BPLO基因顺着GAL10启动子的方向插入到所述PESC-Trp载体的GAL10启动子的下游，使所述BPLO基因处于所述GAL10启动子的控制下，从而得到集成了LUP基因表达框和BPLO基因表达框的质粒PESC-TRP-LUP-BPLO，其中所述LUP基因的序列如SEQ ID NO:1所示，所述GAL1启动子的序列如SEQ ID NO:3所示，所述BPLO基因的序列如SEQID NO:2所示，所述GAL10启动子的序列如SEQ ID NO:4所示；2)通过定点突变的方法将所述质粒PESC-TRP-LUP-BPLO中所述LUP
\t基因中GATATC中的胞嘧啶突变为胸腺嘧啶；3)用EcoRV酶切步骤2)中得到的突变的质粒PESC-TRP-LUP-BPLO，使其线性化，然后将所述线性化的质粒PESC-TRP-LUP-BPLO转入酿酒酵母WAT11中，通过...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈国平，陈斌，章焰生，周晨，
申请(专利权)人：湖北仁悦药业股份有限公司，中国科学院武汉植物园，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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