本发明专利技术公开了一种产鸡溶菌酶的基因工程菌及其建方法与应用，公开了一株产鸡溶菌酶的基因工程菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2015年5月5日，保藏号为CGMCC No.10780。本发明专利技术采用重组DNA技术将鸡(Gallus gallus)的溶菌酶(lysozyme)cDNA克隆连接到毕赤酵母表达载体pPICZαA，并转化毕赤酵母X-33，经筛选鉴定得到一株产高活性鸡溶菌酶的重组毕赤酵母x-33pPICZαA-α-lysozyme。该菌株表达的鸡溶菌酶在摇瓶中的酶活为5000-7000u/ml，为鸡溶菌酶的大规模生产奠定了良好的基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种产鸡溶菌酶的基因工程菌，属于基因工程
技术介绍
溶菌酶是一种无毒、无副作用的蛋白质，又具有一定的溶菌作用，因此可用作天然的食品防腐剂。现已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐；还可以添入乳粉中，使牛乳人乳化，以抑制肠道中腐败微生物的生存，同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖。溶菌酶作为一种存在于人体正常体液及组织中的非特异性免疫因素，具有多种药理作用，它具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效，医用溶菌酶其适应症为出血、血尿、血痰和鼻炎等，溶菌酶具有破坏细菌细胞壁结构的功能，以此酶处理G+细菌得到原生质体，因此，溶菌酶是基因工程、细胞工程中细胞融合操作必不可少的工具酶。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种产鸡溶菌酶的基因工程菌NCY-02，用于鸡溶菌酶的生产。本专利技术的基因工程菌已于2015年5月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.10780，分类学命名为毕赤酵母(Pichiapastoris)x-33-pPICZαA–lysozyme。本专利技术的技术方案如下：一株产鸡溶菌酶的酵母基因工程菌NCY-02，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国科学院微生物研究所，保藏日期为2015年5月5日，保藏号为CGMCCNo.10780。本专利技术第二方面公开了前述产鸡溶菌酶酵母基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：1)合成SEQIDNO：1所示的鸡溶菌酶表达序列；2)将步骤1)所述鸡溶菌酶表达序列连接到毕赤酵母载体pPICZα上，得到重组质粒pPICZαA-lysozyme；3)将步骤2)的重组质粒pPICZαA-lysozyme转化毕赤酵母x-33，得到产鸡溶菌酶的基因工程菌毕赤酵母x-33-pPICZαA–lysozyme。进一步，步骤2)中，将鸡溶菌酶表达序列采用限制性内切酶xhoI和NotI进行双酶切，连接到同样用xhoI和NotI双酶切回收后的毕赤酵母载体pPICZα上，获得重组质粒pPICZαA-lysozyme。本专利技术第三方面公开了前述产鸡溶菌酶酵母基因工程菌在鸡溶菌酶生产中的应用。进一步，产鸡溶菌酶酵母基因工程菌的种子培养基采用YPD培养基；基本发酵培养基采用BMGY培养基；诱导培养基为BMMY培养基。本专利技术的有益效果是：本专利技术的产鸡溶菌酶酵母基因工程菌表达的鸡溶菌酶在摇瓶培养后的酶活可以达到5000-7000u/ml左右，10L机械搅拌生物反应器水平上发酵酶活可以达到20000u/ml以上。该构建菌株发酵生产鸡溶菌酶取代目前从蛋清中提取的生产方法，具有生产周期短、分离纯化成本低等一系列优点，而且发酵生产过程中产生的废弃物——酵母细胞有着广泛的应用价值，这为该菌株大规模生产鸡溶菌酶奠定了良好的基础。附图说明图1：pPICZαA质粒图谱；图2：重组质粒的酶切图谱(其中，M为DL5000DNAmarker，编号1是线性化质粒pPICZα，编号2-7为双酶切的重组质粒pPICZαA-lysozyme)；图3：质粒酶切结果(其中，M为DL5000DNAmarker,编号1是线性化质粒pPICZα，编号2-5为Bglll线性化重组质粒pPICZα-lysozyme)；图4：重组毕赤酵母诱导表达后考马斯亮蓝染色电泳图(其中，M1和M2为蛋白标准品，编号1-8为诱导表达后的重组蛋白)。具体实施方式以下结合附图1-4对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。实施例1重组菌的构建及鉴定通过NCBI收录的鸡溶菌酶基因GenBank:J00882.1，设计出鸡溶菌酶表达序列(两端插入了xhoI和xbaI酶切位点)，如SEQIDNO：1所示，并交由上海生工生物工程股份有限公司合成，连接于puc57载体，获得puc57-lysozyme。用限制性内切酶xhoI和NotI分别双酶切puc57-lysozyme和酵母载体pPICZα，并回收。用T4DNA连接酶于4℃过夜连接，连接产物转化进入感受态大肠杆菌，37℃摇菌1小时，涂布在含有博来霉素(zeocin，0.25ug/ul)的LB平板上，37℃过夜培养，挑选菌落并提质粒，最终获得含有鸡溶菌酶基因的重组表达质粒pPICZαA-lysozyme，用双酶切进行验证，验证结果如图2所示。将验证正确的重组质粒pPICZαA-lysozyme电击转化毕赤酵母x-33(Pichiapastorisx-33)感受态细胞，得到基因工程菌，并经过鉴定命名为毕赤酵母(Pichiapastoris)x-33-pPICZαA-lysozyme。毕赤酵母的转化采用电转化法为：将毕赤酵母x-33于50mLYPD中培养至OD600＝1.2，1500g离心收集细胞；依次用50mL,25ml冰冷的无菌水洗两次细胞，再用10mL冰冷的1mol/L山梨醇洗一次细胞，重悬细胞于100ul1mol/L山梨醇液中，获得感受态细胞。取80μL酵母感受态细胞，与5-10μg线性化重组质粒DNA(BglII酶切)混合，转入冰冷的电转杯，放置5分钟；电击感受态细胞与线性化DNA的混合物(2kv，15ms)；加入1mL冰冷的1mol/L山梨醇，吸入15ml离心管中，在30℃静止放置1h；然后涂布于固体YPDS培养基，在30℃培养4～6天后挑取单克隆，获得产鸡溶菌酶的基因工程菌株，用BglII酶切进行验证，验证结果如图3所示。实施例2重组菌的诱导表达和蛋白电泳1.培养基的配制YPD培养基(1L)：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，葡萄糖20g；YPDS固体培养基(1L):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，葡萄糖20g,182.2g山梨醇，20g琼脂粉；BMGY培养基(1L)：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甘油10mL，YNB13.4g，100mM磷酸缓冲液(pH6.0)，40mg生物素；BMMY培养基(1L)：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甲醇5mL，YNB13.4g，100mM磷酸缓冲液(pH6.0)，40mg生物素。2.鸡溶菌酶诱导表达方法以实施例1获得的产鸡溶菌酶酵母基因工程菌为生产菌株，活化后，将30℃，220rpm下培养过夜的种子(YPD培养基)以10％的接种量转入基本发酵培养基(BMGY培养本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株产鸡溶菌酶的酵母基因工程菌NCY‑02，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国科学院微生物研究所，保藏日期为2015年5月5日，保藏号为CGMCC No.10780。
【技术特征摘要】
1.一株产鸡溶菌酶的酵母基因工程菌NCY-02，保藏于中国微生物菌
种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国科学院微生物研究所，
保藏日期为2015年5月5日，保藏号为CGMCCNo.10780。
2.权利要求1所述产鸡溶菌酶酵母基因工程菌的构建方法，包括以下
步骤：
1)合成SEQIDNO：1所示的鸡溶菌酶表达序列；
2)将步骤1)所述鸡溶菌酶表达序列连接到毕赤酵母载体pPICZα上，
得到重组质粒pPICZαA-lysozyme；
3)将步骤2)的重组质粒pPICZαA-lysozyme转化毕赤酵母x-33，
得到产鸡溶菌酶的基因工...
【专利技术属性】
技术研发人员：王向东，宗臣，林剑，单守水，
申请(专利权)人：山东新概念生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。