本发明专利技术公开了一株表达果胶酯酶的酿酒酵母工程菌及应用，属于发酵工程领域。本发明专利技术所提供的酿酒酵母工程菌，是将果胶酯酶的编码基因与α-凝集素的编码基因融合后转化酿酒酵母，重组质粒整合到宿主的染色体NDA上，得到在细胞表面锚定表达果胶酯酶的菌株，果胶酯酶酶活达到2.6U/g。所述菌株用于甘薯和木薯等原料的酒精发酵生产，不仅能够提高酒精发酵效率，而且能显著降低发酵过程中发酵液的粘度，有利于酶的作用和酿酒酵母代谢，还可以降低设备负担，节约能耗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，特别是一株在细胞表 面锚定表达果胶酯酶的酿酒酵母菌株及其应用，属于发酵工程领域。
技术介绍
化石燃料的日渐枯竭和全球范围内的环境保护要求，为燃料酒精产业带来了很好 的发展机遇。燃料酒精是一种可再生的清洁能源，在汽油中添加一定比例的酒精，能够显著 降低汽车尾气对环境的污染。我国是继美国、巴西后的世界第三大燃料酒精主产国，年产量 达151. 8万吨，并逐年增产。淀粉质原料是生产燃料酒精的主要原料，原料中胶体、果胶质 等粘性物质较多，高浓度发酵时醪液的粘度很大，发酵液传质传热能力差，严重影响酶的作 用效果和酿酒酵母代谢活动，影响乙醇产量。醪液粘度高还会堵塞输送管道、增加设备运转 负担，提高后期固液分离的处理难度，给酒精的浓醪发酵带来困难。 果胶质是植物细胞壁的重要组成部分，与纤维素、半纤维素以及某些伸展蛋白相 互交联，起着支撑细胞结构的作用，它也是细胞间质的填充剂，影响细胞间的粘连和组织的 硬度。果胶酯酶是果胶酶的一种，在纺织、造纸、污水处理等行业都有应用，在食品工业特别 是果蔬加工中应用较多，果胶酯酶可以保持果粒的完整性，有利于果汁的过滤和浓缩，提高 出汁率。果胶酯酶还可以用于酶法制备低甲基果胶，低甲氧基果胶食品具有含糖少、热量低 等特点，符合健康饮食的要求。
技术实现思路
本专利技术提供了首先一株表达果胶酯酶的酿酒酵母工程菌，是融合表达了果胶酯酶 的编码基因 PE和α -凝集素的编码基因 AGa 1，得到在细胞表面锚定表达果胶酯酶的酿酒 酵母工程菌。 在本专利技术的一种实施方式中，所述果胶酯酶的编码基因 PE的核苷酸序列如 GenBank ΧΜ_001390469 所示。 在本专利技术的一种实施方式中，所述α-凝集素的编码基因 AGa 1的核苷酸序列如 GenBank Μ28164 所不。 在本专利技术的一种实施方式中，果胶酯酶的编码基因 PE和α-凝集素的编码基因 AG α 1通过酿酒酵母磷酸甘油激酶PGK启动子在酿酒酵母基因组中整合表达；以alpha因 子信号肽指导蛋白质的定位。 在本专利技术的一种实施方式中，果胶酯酶的编码基因 PE和α-凝集素的编码基因 AGa 1通过带有酿酒酵母磷酸甘油激酶PGK启动子、G418抗性基因、用于同源整合位点的序 列的载体PMD18-T整合到酿酒酵母基因组中进行整合表达。 所述酿酒酵母工程菌的果胶酯酶酶活为2. 6U/g湿菌体。 本专利技术还提供了一种利用上述酿酒酵母工程菌生产酒精的方法，是以淀粉质原料 配制发酵培养基，接种所述酿酒酵母工程菌，静止发酵。 在本专利技术的一种实施方式中，是以木薯粉或/和玉米粉配制发酵培养基，接种所 述酿酒酵母工程菌，静止发酵。 在本专利技术的一种实施方式中，所述以木薯粉或/和玉米粉配制发酵培养基的方法 为：按1:3 (g/mL)的比例将木薯粉或/和玉米粉/与去离子水混合，调pH至6. 0,加入IOU/ g耐高温α淀粉酶，加热料液至95°C，维持2h ;降至室温后调pH至4. 5,添加去离子水以弥 补水分损失。高压蒸汽灭菌，降温后加入130U/g糖化酶和0. 05%的尿素。 本专利技术所提供的酿酒酵母工程菌，在以木薯粉或/和玉米粉为原料的同步糖化发 酵产酒精时，生长速度高于出发菌株，同时酒精产量相较出发菌株提高了 2. 2%。更为重要 的是酿酒酵母工程菌发酵过程中，表面展示的果胶酯酶活性能够有效降解物料中的果胶物 质，从而显著降低发酵液粘度。以发酵12h为例，重组酵母的发酵液粘度为120mPa. s，相比 出发菌株的发酵液粘度145mPa. s，降低了 20. 8%，粘度的降低有利于酶的作用和酿酒酵母 代谢，还可以降低设备负担，节约能耗。【附图说明】 图1为带信号肽的果胶酯酶基因 PCR产物和重组质粒pMGK-AG-PE酶切产物电泳 图 图2为酿酒酵母转化子的染色体DNA的PCR产物电泳图 图3为酿酒酵母工程菌PE发酵过程中的葡萄糖和酒精变化图 图4为酿酒酵母工程菌PE发酵的过程中发酵液的粘度变化【具体实施方式】 果胶酯酶的酶活的测定：采用碱滴定法，具体操作：将2. 5mL 1 %的果胶溶液37°C 预热1011^11，加入50(^1^待测酶液，37°(：反应301^11，煮沸151^11灭活，以0.02111〇1吨-1恥0!1 滴定至pH 8. 0。酶活定义为：在37°C、pH 5. 0条件下，每分钟作用果胶产生1 μ mol羧基所 需的酶量定义为1个酶活力单位。 种子培养基配方如下：2%葡萄糖，0.85%酵母粉，0. 13%氯化铵，0.01%硫酸镁， 0. 006 %氯化|丐，115 °C高压蒸汽灭菌。 发酵培养基配制方法如下：按l:3(w/v)的比例将甘薯粉与去离子水混合，调pH至 6. 0,加入耐高温α淀粉酶（l〇U/g)。加热料液至95°C，维持2h。降至室温后调pH至4. 5， 添加去离子水以弥补水分损失。121°C高压蒸汽灭菌，降温后加入糖化酶（130U/g)和尿素 (终浓度0.05% )。 发酵过程中葡萄糖的消耗和酒精的分析：用高效液相色谱分析，色谱柱为Aminex HPX-87H离子交换柱，流动相为lOmmol/L H2SO4，流速0. 8mL/min，柱温65°C ;发酵初始的总 糖采用酸水解法测定，DNS法测还原糖，以公式：发酵效率=实测发酵酒精浓度八初始总糖 浓度*0. 511) *100%计算发酵效率。 实施例1构建酿酒酵母工程菌（Saccharomyces cerevisiae)PE 1、含有果胶酯酶编码基因的重组质粒pMGK-AG-PE的构建 按照试剂盒操作步骤，用试剂盒提取黑曲霉的总RNA并以此为模板，逆转 录合成一链cDNA，根据PE基因序列（GenBank号为ΧΜ_001390469)设计引物PEf : ATGGTTAAGTCAATTCTTGCATCCGT 和 PEr :TTAGTTGATGTAGCTAG，并以一链 cDNA 为模板，PCR 扩 增含不含自身信号肽的完整果胶酯酶基因，插入到载体PPIC9K的SnaBI位点，获得重组质 粒pPIC9k-PE。根据pPIC9K中的alpha因子信号肽的核苷酸序列设计上游引物PE1，根据 PE基因序列（GenBank号为XM_001390469)，设计下游引物PE2,引入EcoR I酶切位点，引物 序列如下 上游引物 PEl ：CCGGAATTCCGATGAGATTTCCTTCAA 下游引物 PE2 ：CCGGAATTCTTAGTTGATGTAGCTAG,以重组质粒 pPIC9k_PE 为模板，以 PEl和PE2为上下游引物，进行PCR扩增。将得到的PCR产物进行1 %的琼脂糖凝胶电泳， 电泳结果如图2所示，得到一条约1270bp的特异性条带，其大小与预期相同，表明扩增得到 含alpha因子信号肽的果胶酯酶基因 sPE。 将α -凝集素的编码基因 AG a 1的PCR扩增产物片段和载体pMGK用sal I酶切 后连接，获得重组质粒PMGK-AG。载体pMGK的构建，是以pMD18-T为出发载体，在sal I 位点插入酿酒酵母磷酸甘油激酶PGK启动子、在Not I位点插入G418抗性基因，在Nde I 位点插入一当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株表达果胶酯酶的酿酒酵母工程菌，其特征在于，是融合表达了果胶酯酶的编码基因PE和α‑凝集素的编码基因AGα1，得到在细胞表面锚定表达果胶酯酶的酿酒酵母工程菌。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈献忠，肖艳，沈微，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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