本发明专利技术提供了一种基因工程菌株、培养方法及该基因工程菌株的用途，该基因工程菌株包括如下两种形式中一种：a、敲除了绿针假单孢菌中DHHA异构酶phzF基因；b、在敲除了绿针假单孢菌中DHHA异构酶phzF基因的基础上进一步敲除了绿针假单胞菌基因组中的pykF基因。该培养方法为无痕敲除绿针假单孢菌中DHHA异构酶phzF基因或绿针假单胞菌基因组中的pykF基因。该基因工程菌株可以用于2,3‑二氢‑3‑羟基邻氨基苯甲酸中的制备。与现有技术相比，本发明专利技术具有如下的有益效果：1、用于生产DHHA的菌株为绿针假单胞菌，至今未有致病性的报道，因此其环境友好，安全可靠；2、DHHA为GP72的天然代谢中间体，无需外源基因的引入，因此更加安全可靠。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基因工程菌株、培养方法及该基因工程菌株的用途，属于生物工程领域。
技术介绍
2,3-二氢-3-羟基邻氨基苯甲酸(Trans-2,3-dihydro-3-hydroxyanthranilicacid,DHHA)，也叫(5S,6S)-6-氨基-5-羟基-1,3-环己二烯甲酸((5S,6S)-6-amino-5-hydroxy-cyclohexa-1,3-dienecarboxylic acid，2,3-trans-CHA)，CAS编号38127-17-2，分子式C7H9NO3，结构式如下，是一种重要的通过分支酸途径的中间代谢产物。DHHA由McCormick等人在1962年报道，在一株低产四环素的金色链霉菌(Streptomycesaureofaciens)NRRL 2209中分离得到，并通过化学分析，确认产物结构为2,3-二氢-3-羟基邻氨基苯甲酸(DHHA)。DHHA最早被认为是四环素合成的重要中间产物，但由同位素最终实验，证实DHHA并非四环素合成的中间产物。2001年，M.McDonald等人在荧光假单胞菌的分支酸衍生物合成途径(2-羟基吩嗪以及吩嗪-1-羧酸)的一种中间代谢产物，由分支酸经过PhzE及PhzD基因表达的酶催化后产生。2009年，R.Bujnicki通过在删除了完整的芳香族氨基酸竞争途径，从而改善了分支酸供应量的大肠杆菌中，通过异源表达phzD，phzE两个基因，在2升发酵规模，限定L-酪氨酸的分批补料的发酵条件下，得到12g/L的DHHA。而近年来，DHHA也被越来越多的用于化学研究中。Steel等人2003年的研究中发现，外消旋的DHHA，可被立体选择性的氧化，此外，DHHA及其衍生物已经被利用于环加成的反应中，具有一定的化学用途。于此同时，作为环状β氨基酸家族的一员，DHHA具有作为非天然的肽合成的起始材料，目前已经引起了越来越多人的兴趣。此外，DHHA还可作为手性催化剂用于不对称合成反应中，如脯氨酸等α氨基酸的合成。利用Zn2+-DHHA的复合物作为在水溶液中的催化剂，可以成功将4-硝基苯甲醛和丙酮转化成相应的醛醇缩合产物，具有较高的选择反应性。2,3-二氢-3-羟基邻氨基苯甲酸(DHHA)现在已被大量关注，其作为吩嗪合成途径的中间代谢产物，可以在绿针假单胞菌中被自然的合成，然后再通过PhzF等酶的作用，最终转化为PCA。已有研究通过大肠杆菌生产DHHA，如欧洲专利EP1728872 A1公开了一种(5S,6S)-6-氨基-5-羟基-1,3-环己二烯甲酸(2,3-CHA)的生物合成。其在技术上是通过异源表达假单胞菌基因phzE、phzD从而在大肠杆菌KB532生产DHHA，其工程菌株的构建更为繁琐，副产物成分更加复杂。而绿针假单胞菌是非致病菌，对人体无害，且只需要通过缺失phzF基因即可生产DHHA，无需异源表达其他基因，构造更为简便快捷，发酵产物成分较简单，因此是生产DHHA最佳天然菌株。
技术实现思路
针对现有技术中的缺陷，本专利技术的目的是提供一种基因工程菌株、培养方法及该基因工程菌株的用途，该方案可填补利用绿针假单胞菌生产DHHA的空白。本专利技术是通过以下技术方案实现的：第一方面，本专利技术提供了一种基因工程菌株，该基因工程菌株敲除了绿针假单孢菌中DHHA异构酶phzF基因；作为优选方案，所述DHHA异构酶phzF基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。作为优选方案，所述DHHA异构酶phzF基因的对应蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。第二方面，本专利技术提供了一种如前述的基因工程菌株的制备方法，其包括如下步骤：扩增phzF基因上下游同源臂片段；融合PCR连接上下游同源臂，并插入pK18mobsacB质粒中；使融合的phzF基因上下游同源臂与GP72基因组发生同源重组，利用蔗糖压力和抗性筛选出阳性克隆，即可；或扩增pykF基因上下游同源臂片段；融合PCR连接上下游同源臂，并插入pK18mobsacB质粒中；使融合的pykF基因上下游同源臂与GP72基因组发生同源重组，利用蔗糖压力和抗性筛选出阳性克隆，即可；所述pK18mobsacB质粒带有蔗糖致死基因和卡那抗性基因。作为优选方案，用于敲除phzF基因的上游同源臂的碱基序列如SEQ ID NO.3以及SEQ ID NO.4所示；下游同源臂的碱基序列如SEQ ID NO.5以及SEQ ID NO.6所示。作为优选方案，用于敲除pykF基因的上下游同源臂的碱基序列如SEQ ID NO.9以及SEQ ID NO.10所示；下游同源臂的碱基序列如SEQ ID NO.11以及SEQ ID NO.12所示。第三方面，本专利技术还提供了一种用于培养前述的基因工程菌株的培养基，包括如下组分：甘油、蛋白胨、硫酸镁、磷酸氢二钾、葡萄糖、三氯化铁。作为优选方案，所述培养基包括按重量份数计的如下组分：第四方面，本专利技术也提供了一种如前述的基因工程菌株在制备2,3-二氢-3-羟基邻氨基苯甲酸中的用途。作为优选方案，所述基因工程菌株在制备2,3-二氢-3-羟基邻氨基苯甲酸时的条件为：好氧培养；温度：26～30℃；pH：6～8；转速150～250rpm。第五方面，本专利技术提供了一种提升前述的基因工程菌株产物产量的基因改造菌株，该基因改造菌株是在敲除了绿针假单孢菌中DHHA异构酶phzF基因的基础上进一步敲除了绿针假单胞菌基因组中的pykF基因。作为优选方案，其中，所述pykF基因的碱基序列如SEQ ID NO.7所示。作为优选方案，其中，所述pykF基因的对应蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。制备方法，包括如下步骤：扩增pykF基因上下游同源臂片段；融合PCR连接上下游同源臂，并插入pK18mobsacB质粒中；使融合的pykF基因上下游同源臂与GP72基因组发生同源重组，利用蔗糖压力和抗性筛选出阳性克隆，即可。作为优选方案，用于敲除所述pyzF基因的用于扩增上游同源臂的碱基序列如SEQ ID NO.9以及SEQ ID NO.10所示；用于扩增下游同源臂的碱基序列如SEQ ID NO.11以及SEQ ID NO.12所示。本专利技术又提供了一种如前述的基因工程菌株在制备2,3-二氢-3-羟基邻氨基苯甲酸中的用途。所述的用途中，所述基因工程菌株在制备2,3-二氢-3-羟基邻氨基苯甲酸时的条件为,好氧培养；温度26～30℃；pH 6～8；转速150～250rpm；本专利技术通过对phzF基因的敲除，阻断DHHA向PCA转化的反应，从而在绿针假单胞菌GP72中富集DHHA，得到一株DHHA的产生菌。同时对pykF进行敲除，可以有效提升DHHA的产量。此外，结合实验室之前对于吩嗪衍生物产量提高的一些经验，进一步提高DHHA的产量，得到可高产DHHA的绿针假单胞菌及适宜发酵条件。而且其原料简单易得，发酵周期短，24h就产生大量DHHA，36h基本可达最高DHHA产量；而且副产物少，易于后续的纯化分离得到DHHA的纯品，因此它是DHHA生产的理想菌种，适合大规模的开发和应用。与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果：1、用于生产DHHA的菌株为绿针假单胞菌，至今未有致病性的报道，因此其环境友好，安全可靠；2、DHHA为GP72的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基因工程菌株，其特征在于，可由如下方法中的一种制备而得：a、敲除了绿针假单孢菌中DHHA异构酶phzF基因，即得；或者b、在敲除了绿针假单孢菌中DHHA异构酶phzF基因的基础上进一步敲除了绿针假单胞菌基因组中的pykF基因，即得。
【技术特征摘要】
1.一种基因工程菌株，其特征在于，可由如下方法中的一种制备而得：a、敲除了绿针假单孢菌中DHHA异构酶phzF基因，即得；或者b、在敲除了绿针假单孢菌中DHHA异构酶phzF基因的基础上进一步敲除了绿针假单胞菌基因组中的pykF基因，即得。2.如权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，其中，所述DHHA异构酶phzF基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。3.如权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，其中，所述DHHA异构酶phzF基因的对应蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.一种如权利要求1所述的基因工程菌株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：扩增phzF基因上下游同源臂片段；融合PCR连接上下游同源臂，并插入pK18mobsacB质粒中；使融合的phzF基因上下游同源臂与GP72基因组发生同源重组，利用蔗糖压力和抗性筛选出阳性克隆，即可；或扩增pykF基因上下游同源臂片段；融合PCR连接上下游同源臂，并插入pK18mobsacB质粒中；使融合的pykF基因上下游同源臂与GP72ΔphzF基因组发生同源重组，利用蔗糖压力和抗性筛选出阳性克隆，即可；所述pK18mobsacB...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡洪波，李一帆，赵嘉，张雪洪，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。