用于生产DHHA的基因工程菌株及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种用于生产DHHA的基因工程菌株及其用途；本发明专利技术从一株分泌吩嗪‑1‑甲酰胺的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO：M2013467出发，敲除该菌株及其衍生物基因组中的吩嗪合成途径的基因phzF，从而积累中间代谢产物DHHA，不再合成吩嗪化合物。该基因工程菌株可以用于DHHA的制备。DHHA可以作为重要的有机合成中间体及手性催化剂，具有重要的应用价值。该基因工程菌株安全可靠，稳定性好，发酵周期短，有利于DHHA的生物合成和工业化应用。

【技术实现步骤摘要】
用于生产DHHA的基因工程菌株及其用途
本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种用于生产2，3-二氢-3-羟基邻氨基苯甲酸(2，3-dihydro-3-hydroxyanthranilicacid，简称DHHA)的基因工程菌株及其用途。
技术介绍
2，3-二氢-3-羟基邻氨基苯甲酸(Trans-2，3-dihydro-3-hydroxyanthranilicacid，DHHA)，也叫(5S，6S)-6-氨基-5-羟基-1，5-环己二烯甲酸((5S，6S)-6-amino-5-hydroxy-cyclohexa-1，5-dienecarboxylicacid，2，3-trans-CHA)，CAS编号38127-17-2，分子式C7H9NO3，是一种重要的通过分支酸途径合成的中间代谢产物。。1962年，由McCormick等人[McCormickJRD，ReichenthalJ，HirschU，etal.(+)trans-2，3-DIHYDRO-3-HYDROXYANTHRANILICACID.ANEWAMINOACIDPRODUCEDBYStreptomycesaureofaciens[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety，1961，83(19)：4104-4105.]在一株当时被认定为金色链霉菌(Streptomycesaureofaciens)NRRL2209的一株低产四环素的突变株中分离得到，并通过元素分析，紫外红外吸收光谱及化学转化的方法，最终确认产物结构为DHHA(DHHA)。2001年，M.McDonald等人在荧光假单胞菌中确认了DHHA作为假单胞菌的吩嗪合成途径的一种中间代谢产物，由分支酸经过PhzE及PhzD催化后产生[McDonaldM，MavrodiDV，ThomashowLS，etal.PhenazineBiosynthesisinPseudomonasfluorescens：BranchpointfromthePrimaryShikimateBiosyntheticPathwayandRoleofPhenazine-1，6-dicarboxylicAcid[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety2001，123(38)：9459-9460]。2009年，R.Bujnicki通过在删除了完整的芳香族氨基酸竞争途径，从而改善了分支酸供应量的大肠杆菌中，通过异源表达phzD，phzE两个基因，在2升发酵规模，限定L-酪氨酸的分批补料的发酵条件下，得到12g/L的DHHA[R.Bujnicki，Dissertation[D]，TUMunchen，2007]。近年来，DHHA也被越来越多的用于化学研究中。Steel等人2003年的研究中发现，以外消旋形成合成的DHHA，可被立体选择性的氧化，反应类似于二醇2，3-trans-CHD及3，4-trans-CHD[BongaertsJ，EsserS，LorbachV，etal.Diversity-OrientedProductionofMetabolitesDerivedfromChorismateandTheirUseinOrganicSynthesis[J].AngewandteChemie，2011，123(34)：7927-7932]的氧化。此外，DHHA及其衍生物已经被利用于环加成(cycloaddition)的反应中[BunnageME，GaneshT，MasesaneIB，etal.Asymmetricsynthesisoftheputativestructureof(-)-oryzoxymycin[J].Organicletters，2003，5(3)：239-242]。DHHA还是环状β氨基酸家族的一员，而环状β氨基酸由于可以作为很多非天然的肽的起始合成材料，因而DHHA还可作为手性催化剂用于不对称合成反应中，如脯氨酸等α氨基酸的合成。利用Zn2+-DHHA的复合物作为在水溶液中的催化剂，可以成功将4-硝基苯甲醛和丙酮转化成相应的醛醇缩合产物，对映体过量值高达88％。这一结果显示出了β-氨基酸作为手性催化剂所具有的巨大潜力，且这一潜力是目前很稀缺的。相比于许多其他的氨基酸，DHHA可以允许灵活的区域选择性和立体选择性的功能化，从而很有可能对催化性能的优化起到促进作用[BunnageME，GaneshT，MasesaneIB，etal.Asymmetricsynthesisoftheputativestructureof(-)-oryzoxymycin[J].Organicletters，2003，5(3)：239-242.]。除此之外，DHHA还可以作为多种物质的合成前体，应用于体外合成实验中，例如作为吩嗪合成代谢的中间产物，其可利用于多种吩嗪衍生物的合成，而DHHA与PhzF等蛋白的体外反应也可以完全的得到PCA。此外，DHHA还可以作为一种白叶枯霉素(-(-)’oryzoxymycin)的不对称合成的前体[BunnageME，GaneshT，MasesaneIB，etal.Asymmetricsynthesisoftheputativestructureof(-)-oryzoxymycin[J].Organicletters，2003，5(3)：239-242.]。由于现有的DHHA合成途径采用基因过表达的方式合成，该菌株在发酵过程中需添加抗生素保持选择性压力，存在菌种的不稳定性问题、生产成本高等问题。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服上述技术中菌种稳定性、代谢产物复杂、菌种改造困难等问题，提供一种用于生产DHHA的基因工程菌株及其用途。本专利技术以一株绿针假单胞菌HT66出发，由于能够高水平合成吩嗪类次级代谢产物，通过敲除其合成途径的phzF基因后就能大量积累DHHA，而且能够保证基因工程菌株的稳定性，可以用于DHHA的发酵生产。具体来说，本专利技术以绿针假单胞菌HT66为出发菌株，通过基因工程技术将HT66菌株中次级代谢产物吩嗪-1-羧酸合成途径的结构基因phzF敲除，构建HT66ΔphzF基因工程菌株，可以高效合成DHHA，可以用于DHHA的工业化生产。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：第一方面，本专利技术提供一种用于生产2，3-二氢-3-羟基邻氨基苯甲酸(DHHA)的基因工程菌株，敲除绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)HT66CCTCCNO：M2013467及其衍生物基因组中的phzF基因以积累DHHA。作为优选方案，所述phzF基因的碱基序列如SEQIDNO.1所示。作为优选方案，所述phzF基因的对应蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。作为优选方案，敲除所述phzF基因的方法包括插入突变法和无痕法。作为优先方案，插入突变法敲除phzF基因包括如下步骤：S1、扩增phzF基因片段，并插入pEX18Tc质粒中；S2、扩增卡那霉素或庆大霉素等抗性基因，插入phzF基因中间，使phzF基因发生插入突变；S3、将突变后的phzF基因与HT66基因组中的phzF基因发生同源重组，根据抗性筛选出阳性克隆，即可。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于生产2,3‑二氢‑3‑羟基邻氨基苯甲酸的基因工程菌株，其特征在于，敲除绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M2013467及其衍生物基因组中的phzF基因。

【技术特征摘要】
1.一种用于生产2,3-二氢-3-羟基邻氨基苯甲酸的基因工程菌株，其特征在于，敲除绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)HT66CCTCCNO:M2013467及其衍生物基因组中的phzF基因。2.如权利要求1所述的用于生产2,3-二氢-3-羟基邻氨基苯甲酸的基因工程菌株，其特征在于，所述phzF基因的碱基序列如SEQIDNO.1所示。3.如权利要求1所述的用于生产2,3-二氢-3-羟基邻氨基苯甲酸的基因工程菌株，其特征在于，所述phzF基因的对应蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。4.如权利要求1、2或3所述的用于生产2,3-二氢-3-羟基邻氨基苯甲酸的基因工程菌株，其特征在于，敲除所述phzF基因的方法包括插入突变法和无痕敲除法。5.如权利要求4所述的用于生产2,3-二氢-3-羟基邻氨基苯甲酸的基因工程菌株，其特征在于，所述插入突变法敲除phzF基因包括如下步骤：S1、扩增phzF基因片段，并插入pEX18Tc质粒中；S2、扩增卡那霉素或庆大霉素等抗性基因，插入phzF基因中间，使phzF基因发生插入突变；...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭华松，张雪洪，侯博文，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海,31