一种灭活的白细胞介素-2基因工程人胃癌细胞瘤苗的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种灭活的白细胞介素－２基因工程人胃癌细胞瘤苗的制备方法。从经ＰＨＡ诱导的人外周血单核细胞中抽提ｍＲＮＡ，在体外合成ｃＤＮＡ，运用聚合酶链反应技术克隆了含有信号肽的白细胞介素－２　ｃＤＮＡ，并与缺陷型逆转录病毒载体ＬＸＳＮ进行重组，构建了含白细胞介素－２　ｃＤＮＡ的重组逆转录病毒载体Ｌ（ＩＬ－２）ＳＮ。采用安全性较高的第二代包装细胞ＰＡ３１７对含ＩＬ－２基因的缺陷型逆转录病毒载体Ｌ（ＩＬ－２）ＳＮ进行包装，产生出具有高滴度且不具有复制能力的重组逆转录病毒，感染人胃癌细胞株ＭＫＮ－４５，建立了具有白细胞介素－２表达活性的基因工程人胃癌细胞，应用↑［６０］Ｃｏ照射，在摸索了不同的照射剂量后，制备了灭活白细胞介素－２基因工程人胃癌细胞瘤苗。

Method for preparing inactivated interleukin -2 gene engineering human gastric cancer cell vaccine

The invention provides a preparation method of inactivated interleukin 2 gene engineering human gastric cancer cell vaccine. Extraction of mRNA from PHA induced by human peripheral blood mononuclear cells, in vitro synthesis of cDNA by polymerase chain reaction and cloned interleukin - 2 peptide containing the signal peptide cDNA and defective retroviral vector LXSN was constructed by recombinant interleukin - 2 recombinant retroviral vector cDNA L SN (2). The high security of the second generation of PA317 packaging cell deficient L retroviral vector containing IL 2 gene (IL 2) SN packaging, produce high titer recombinant retrovirus and do not have the ability to replicate, infection of human gastric cancer cell line MKN 45, built with interleukin 2 the expression activity of genetically engineered human gastric cancer cells, increase the application of 60 Co irradiation has different irradiation dose, preparation of inactivated interleukin 2 gene engineering vaccine of human gastric cancer cells.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程领域，更具体地，本专利技术提供了一种白细胞介素-2基因 工程人胃癌细胞瘤苗的制备方法。
技术介绍
原发性胃癌为我国高发的恶性肿瘤。在胃癌治疗历史上，手术切除是主要手段，但术后常复发。胃癌晚期(in期)患者，常缺乏有效的延长病人生命的治疗方 法。若这些胃癌患者经一些有效的辅助治疗措施使胃癌肿瘤缩小后，再行切除， 有可能使胃癌治疗有一个突破。90年代新兴的肿瘤基因治疗已成为肿瘤生物治疗的重要措施之一，并被誉 为继手术、化疗和放疗之后的另一种具有潜在前途的治疗方法。近年来肿瘤基因治疗的研究无论从深度上还是广度上都取得了很大进展。在获得美国重组DNA 咨询委员会(RAC)、 NIH专家委员会和FM批准的基因治疗临床试验方案中，以 肿瘤为最多，充分显示基因治疗在肿瘤研究中的迫切性。目前所开展的肿瘤基因 治疗中，以肿瘤免疫基因治疗的研究为最多。肿瘤细胞耙向的细胞因子基因治疗 是以主动免疫治疗为基础，即将细胞因子基因转导入肿瘤细胞中，以制备出免疫 原性更强的新型瘤苗，并由于细胞因子的持续分泌，从而激发机体产生抗肿瘤免 疫反应，达到治疗肿瘤的目的。研究表明，细胞因子基因治疗不仅在一定程度上 克服了以往临床直接应用细胞因子需反复多次且副作用明显的缺点，而且也取得 了直接应用所不具有的疗效。白细胞介素-2是由活化T细胞所分泌的一种细胞因子，具有刺激多种免疫 效应细胞活化的作用，包括T细胞、B细胞、NK细胞和巨噬细胞等。在肿瘤免疫 中起到重要作用。十多年前已开始将重组白细胞介素-2应用于临床恶性肿瘤病 人。这种白细胞介素-2的系统性应用在黑色素瘤及其它一些肿瘤病人中取得一 定的效果，报道有效率为15 20%。这种疗法主要是基于白细胞介素-2可使T细 胞活化，从而有助于杀伤肿瘤细胞。然而由于白细胞介素-2在血液中的半衰期较短，而反复多次大剂量的应用又产生严重的毒副作用，因而限制了白细胞介素 -2的临床应用。1990年，两个研究小组分别报道了应用基因工程技术，将白细胞介素-2基因 转导至肿瘤细胞。动物实验结果表明，可分泌白细胞介素-2的肿瘤细胞丧失了致 瘤性。进一步观察发现，体内接种白细胞介素-2基因转导的肿瘤细胞后可抵抗后 续野生型肿瘤的攻击。这些数据表明(l)基因修饰的肿瘤细胞自身可与T细胞 相互作用，(2)肿瘤细胞分泌的白细胞介素-2可替代辅助T细胞的作用，来激活 肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞。类似的研究结果在多种肿瘤模型中相继得到 证实，包括肠癌(CT26)、纤维肉瘤(CMS5)、肥大细胞瘤(P815)、黑色素瘤(M-3y 等。我们在动物肿瘤模型研究中也发现，白细胞介素-2基因修饰的小鼠肿瘤细胞 H22及MM45T丄i均显著降低其致瘤性，并能有效保护后续野生型肿瘤的攻击。与此同时，在全世界范围内，应用白细胞介素-2基因工程瘤苗的临床试验不 断获得批准，在细胞因子基因修饰肿瘤细胞的临床试验方案中，以白细胞介素-2 基因应用最多。目前已有23个相关治疗方案获得批准，涉及到的肿瘤类型包括 黑色素瘤、肾癌、肠癌、前列腺癌、头颈部肿瘤及肺癌等。在所应用的基因转移系统中，逆转录病毒载体系统应用最早，对其研究也很 深入。该系统最大的优点是可以前病毒形式稳定整合至宿主基因组中，从而使目 的基因的长期稳定表达成为可能。尽管这种整合形式有可能导致宿主基因组的插 入突变(insertion mutation),但采用安全的ex vivo治疗方案，可使插入突变对机 体带来的潜在危险降至最低。此外，作为第二代复制缺陷型逆转录病毒载体系统， LXSN系统更为安全，产生有复制能力的野生型病毒的可能性很小。该载体系统 也是被美国FDA获得批准可应用于临床试验的载体之一。自1990年应用逆转录 病毒载体于临床基因治疗以来，尚无发现该病毒的毒副反应报道。本专利技术提供了一种白细胞介素-2基因工程人胃癌细胞瘤苗的制备方法，为癌 症的治疗提供了一种新的治疗途径。
技术实现思路
本专利技术提供了一种白细胞介素-2基因工程人胃癌细胞瘤苗的制备方法。包括4mRNA的抽提及cDNA的合成、PCR扩增IL-2基因、IL-2 cDNA的克隆、 含IL-2重组逆转录病毒载体的组建、白细胞介素-2重组逆转录病毒包装细胞制 备、人胃癌细胞株M認-45的感染，白细胞介素-2表达活性的基因工程人胃癌细 胞的建立及瘤苗的灭活。附图说明无。具体实施例方式第一步含信号肽的白细胞介素-2 cDNA的制备。1. PHA剌激的人外周血细胞人外周血用淋巴细胞分离液分离出单 个核细胞，共约"106细胞，经植物血凝素(PHA)10ng/ml剌激30小时， 使细胞因子基因表达，以备抽提mRNA。2. mRNA的抽提及cDNA的合成(1) mRNA的抽提离心收集细胞，悬浮于1.5mlRNA抽提缓冲液， 用注射器反复抽打匀桨细胞，然后再补加3ml抽提缓冲液，充分混合，离 心1000 cpm5分钟，收集上清。取Oligo (dT)-Cellulose Spun Column,混 合内容物，350g离心两分钟，弃去柱内液体，取4ml上清上柱，混匀，弃 去液体。然后用高盐缓冲液洗三遍，低盐缓冲液洗二遍，最后用经65°C预 热的洗脱缓冲液洗脱三次，每次用0.25ml，收集洗脱液，然后乙醇沉淀 poly(A) +RNA(mRNA)。(2) cDNA的合成将mRNA溶于20pl ddH20中，65°C10分钟，置于 冰上备用。在第一条链反应混合液内加入lmlDTT和热变性的RNA， 37 'C保温1小时，再将此反应液加入第二条链反应混合液中，12°C和22°C 各保温1小时，最后加lpl Klenow酶，37°C 30分钟，65°C10分钟后再 用酚和氯仿抽提，经Sephacryl S-300柱纯化后-20。C保存。2. PCR扩增IL-2基因取制备好的PBLcDNA10pl，加入5'和3'扩 增引物各lpl( 30pmo1)、 10X反应缓冲液5pl、 dNTP4pl、加水至50^1， 94°C 5分钟变性，力tl Pfu酶1U(2.5U)，进行30个循环反应.(94'C 45"、55TM5"、 72TM'20")。反应结束后，将反应产物用等体积苯酚/氯仿抽提一 次，乙醇沉淀。3. IL-2 cDNA的克隆为了鉴定PCR产物的准确性，须先将产物克 隆入pUC18或pBluescriptDNA， 经DNA序列测定确认为IL-2 cDNA无 误后再将这一片段回收，并与表达载体重组。故将PCR产物溶于TE，用 适当的限制性内切酶水解后，与用同样酶水解过的载体DNA重组，转化 TG1后涂于LB/AP平板，37'C培养过夜。4. 质粒DNA小量抽提将一个单菌落接入含AP(50pg/ml)的3ml LB 中，37。C培养过夜。将菌液转移至1.5ml离心管中，5000rpm离心2分钟， 沉淀菌体。用100pl溶液I悬浮菌体，再加20(^1溶液I1，温和颠倒混匀, 置于冰上，待溶液澄清后，加入150nl溶液m，充分混匀。15000rpm 10 分钟离心，收集上清，用等体积苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，加2.5倍乙 醇混匀，沉淀。离心15000rpm 10分钟，将沉淀用70%乙醇洗一次，水 泵抽干，最后溶于20plT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种灭活的白细胞介素－２基因工程人胃癌细胞瘤苗的制备方法，其特征在于，该胃癌细胞株为ＭＫＮ－４５。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈诗书，钱关祥，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院，上海新生源医药研究有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]