本发明专利技术涉及一种构建基因工程集胞藻生产可生物降解塑料的方法，首先利用聚合酶链式反应技术得到野生型集胞藻的ａｇｐ基因，然后利用分子克隆技术对其进行部分删除，用获得的重组质粒转化野生型集胞藻，最后获得无糖原合成能力、能生产可生物降解塑料ＰＨＢ的基因工程集胞藻，使用本发明专利技术的方法，为利用清洁和清洁原生产环境友好型物质提供了可能。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用构建的基因工程集胞藻生产可生物降解塑料的方法，属于生物技术(特别是生物化工)领域。随着人类社会的不断发展，塑料制品已成为我们必不可少的工业和生活用品，而由石油产品制成的传统塑料的废弃物很难降解。近年来由于大量废旧塑料地膜、包装塑料袋和一次性不可降解塑料餐具的使用量激增，并且任意抛弃，各大、中城市普遍形成了严重的白色污染。它已同汽车尾气、含磷洗涤剂一起被列为我国环保治理的重点。因此，人们把目光投向环境友好型的塑料制品—生物可降解塑料的研制、开发与生产。聚-β-羟基丁酸酯(Poly-β-Hydroxybutyrate，以下简称PHB)是最早发现的一种生物可降解高分子材料。当环境营养条件不平衡时(如限氮或限磷)，很多微生物体内将积累PHB，其物理化学性质与聚丙烯塑料相似，且在自然条件下可被微生物分泌的酶降解，对环境不造成污染。PHB不仅具有通常高分子材料的力学性能和加工性能，还具有化学合成塑料所没有的一些特殊性能，如可生物降解性、生物相容性、光学活性、压电性和抗凝血性等，此外，它的比重大、透氧性低、抗紫外辐射，从而在医药、农业、电子、包装材料等领域具有独特而广泛的应用前景，深受国际生物工程界的重视。1990年，英国帝国化学公司采用异养型细菌真养产碱杆菌，以葡萄糖和丙酸为原料，在限磷条件下发酵，推出了商品名为Biopol的β-羟基丁酸及β-羟基戊酸共聚物塑料。之后，人们又对重组大肠杆菌的PHB生产进行了研究，到目前为止，其表达量一般可达菌体干重的70％左右。但由于发酵所用原料(葡萄糖、蔗糖、丙醇等)价格高、发酵过程中要持续通氧、发酵液的分离纯化困难等原因，使生产的成本过高，产品的市场竞争能力较传统塑料低。为此，大幅度降低PHB的生产成本，成为PHB生产并推向市场所必需解决的一个关键问题。从原料成本考虑，CO2是最廉价的碳源。异养微生物发酵生产PHB所用的有机碳源基本上都是通过光合作用将大气中的CO2固定于绿色植物中，经过一系列的生物化学反应合成而来的。如果将绿色植物光合作用固定下来的CO2直接用于PHB的合成，将是一种从根本上解决原料成本过高问题的理想途径。利用转基因技术将细菌PHB合成酶基因转移至拟南芥(生物技术(Biotechnology)13:142-150；美国国家科学研究进展(Proceedingsof the National Academic Science of USA)91:12760-12764；国际生物大分子杂志(International Journal of Biological Macromolecules)17:7-12)、油菜、马铃薯(植物学报37:581-588；植物学报40:615-621)和棉花(美国国家科学研究进展(Proceedingsof the National Academic Science of USA)93:12768-12773；热化学学报(ThermochimActa)313:43-53)等植物体内，便可在植物中建立PHB合成途径。虽然从降低原料成本看，转基因植物生产PHB具有很大的优势，但由于植物生长周期长、需占用可耕地、PHB表达量低(目前报道的最高水平仅达细胞干重的14％)，产品分离提取困难，大大阻碍了这一技术向实际生产的转化。蓝细菌又称蓝藻，是一种光合放氧自养微生物。蓝细菌与细菌一样，都是原核细胞，其染色体裸露存在于细胞质中。与真核藻类、高等植物相同，蓝细菌可通过光合作用，利用日光能从CO2、水、无机盐合成其全部细胞物质。细胞生长和分裂所需的其它所有分子，都是由这些光合作用的初产物合成的(蓝细菌分子生物学(The Biology ofCyanobacteria),1994,pp217-257)。集胞藻6803(Synechocystis sp.PCC6803)是一种单细胞球状蓝细菌，它具有以下优点结构简单，可在多种条件下生长，既可进行光合自养也可异养生长(应用藻类学杂志(Journal of Applied Physiology)8:263-273)；染色体DNA的全部测序工作已完成，并预测了可能的蛋白质编码区域。可将S.6803的特定基因删除、修饰以研究其功能、作用，也可在某一特定位点引入外源基因改变其代谢途径(DNA研究(DNA Research)3:109-136；DNA研究(DNA Research)3:185-209)；易转化，适于基因操作(酶学方法(Methods in Enzymology)297:18-26)。在正常培养条件下，不需对细胞作任何处理，外源线状或近环状质粒DNA，都容易通过同源重组整合到集胞藻6803的染色体DNA上。而且，用各种抗生素的抗性基因作标记，对集胞藻6803进行转化和筛选都很方便。伴随着对蓝细菌生理学的研究，人们在一些蓝细菌，如佛氏绿胶蓝细菌(生物化学生物物理学报(Biochima Biophysics Acta)120:308-310)、螺旋藻(细菌学杂志(Journalof Bacteriology)149:361-363；细菌学杂志(Journal of Bacteriology)172:2791-2792)、聚球藻(发酵与生物工程杂志(Journal of Fermentation and Bioengineering)82:512-514；细菌学杂志(Journal of Bacteriology)179:5009-5013)、集胞藻(微生物学丛刊(Archives of Microbiology)170:162-170)等中，发现了与细菌体内类似的PHB颗粒，使蓝细菌作为PHB的表达体成为可能。尽管这些蓝细菌具有合成PHB的能力，但PHB在其体内的积累水平并不高。迄今为止，文献报道的最高表达量是在耐热聚球藻中，PHB可积累至细胞干重的20％，比细菌的积累量低得多，但高于转基因植物中的表达量。1996年，日本学者第一次采用基因工程方法，用含真养产碱杆菌PHB合成酶基因的质粒转化聚球藻7942，实现了PHB在无PHB合成能力的蓝细菌中的表达，但转化体中PHB的含量很低，仅达干重的1％(生物技术通讯(Biotechnology Letters)18:1047-1050)。我国关于这方面的研究还未见报道。对蓝细菌积累PHB的研究表明，PHB在蓝细菌体内作为贮存物质的功能已大大退化。蓝细菌体内，碳源及能量贮存物质主要是糖原(微生物学年报(Annual Reviews ofMicrobiology)38:1-25)。在光能自养条件下，指数生长期的细胞可积累糖原达干重的10-20％，而在氮饥饿条件下，糖原可积累至细胞干重的40-60％，也即过剩的碳源绝大部分首先转变为糖原储存起来，仅有很少一部分转变为PHB。当平衡生长条件恢复后，糖原立即分解，释放碳源及能量。由此可见，在蓝细菌体内，糖原取代了PHB的生理功能，糖原的合成在底物上与PHB的合成形成竞争。要想提高蓝细菌体内PHB的表达量，必需控制竞争物质糖原的合成。在蓝细菌中，糖原的合成涉及三个酶二磷酸腺苷(简称ADP)-葡萄糖焦磷酸羧化酶、糖原合成酶以及分支酶，其中ADP-葡萄糖焦磷酸羧化酶用agp基因编码，催化AD本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种构建基因工程集胞藻生产可生物降解塑料的方法，其特征在于，该方法由以下步骤组成：（１）首先从野生型集胞藻中提取染色体ＤＮＡ：其过程为：从固体平板上挑取５－１０个单藻落，接种于装有２００－４００毫升液体培养基的培养瓶中，该培养基记为ＢＧ －１１培养基，每升培养基的组成为：碳酸钠：２０ｇ、磷酸氢二钾：３０．５ｇ、柠檬酸铁铵：６ｇ、硝酸钠：１．５ｇ、硫酸镁：７５ｍｇ、含０．２５ｍｏｌ／Ｌ乙二胺二乙酸二钠、ｐＨ值为８．０的水溶液１１．２μＬ、氯化钙：３６ｍｇ、柠檬酸：６ｍｇ、含２．８６ｇ／Ｌ硼酸、０．２２２ｇ／Ｌ七水硫酸锌、０．０７９ｇ／Ｌ五水硫酸铜、１．８１ｇ／Ｌ四水氯化镁、０．３９ｇ／Ｌ二水钼酸钠、０．０４９ｇ／Ｌ六水硝酸钴的微量元素液１ｍＬ，在温度为２４－３２℃、光照密度为１０００－３０００ｌｘ的光照培养箱中通气培养至培养液在７３０纳米下的吸光值为０．３－１．０；将培养液转移至２００－３００毫升离心杯中，于１５－２５℃、３０００－５０００转／分的条件下离心５－１５分钟，按照常规蓝细菌ＤＮＡ提取方法对所得藻细胞进行处理，得到野生型集胞藻的染色体ＤＮＡ沉淀，加入０．２－０．６ｍＬ的含１．２１ｇ／Ｌ三羟甲基氨基甲烷及０．３７２ｇ／Ｌ二水合乙二胺二乙酸二钠、ｐＨ８．０的缓冲液中，溶解沉淀，备用；（２）以野生型集胞藻染色体ＤＮＡ为模板，按集胞藻ａｇｐ基因的上游与下游核苷酸顺序合成寡核苷 酸为引物。引物中含有脱氧腺嘌呤核苷三磷酸（记为Ａ）、脱氧鸟嘌呤核苷三磷酸（记为Ｇ）、脱氧胞嘧啶核苷三磷酸（记为Ｃ）、脱氧胸腺嘧啶核苷三磷酸（记为Ｔ），所合成的引物一为：５’－磷酸－Ｃ－Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｔ－Ｃ－Ｃ－Ｇ－Ｇ－Ａ－Ｔ－Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ａ－Ａ－Ｃ－Ｇ－Ｇ－Ｃ－Ｇ－磷酸－３’；引物二为：５’－磷酸－Ｇ－Ｇ－Ｃ－Ｃ－Ｇ－Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｔ－Ｃ－Ａ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ａ－Ｔ－Ｔ－Ｔ－Ｔ－Ａ－Ｃ－Ｔ－Ｇ－Ｃ－Ｔ－Ｔ－Ｔ－磷酸－３’，引物合成后，用无菌水溶解沉淀至浓度为５０－１００μｍｏｌ／Ｌ，备用；（３）取３－１０μＬ步骤１制备的染色体ＤＮＡ溶液于一已灭菌的离心管中，依次加入２０－４０μＬ无菌水、５－１５μＬ的扩增缓冲液、５－１５μＬ的四种脱氧核苷酸、０．５－１．５μＬ的由步骤２合成的引物一、０．５－１．５μＬ的由步骤２合成 的引物二、０．５－１μＬ的Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶，用无菌水补足至总体积为１００－１５０μＬ，再加入６０－１２０μＬ的石蜡油；将离...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：沈忠耀，吴桂芳，吴庆余，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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