基因工程细胞及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种基因工程细胞及其应用，所述工程细胞的基因组中编码糖链修饰相关酶α‑1，6‑岩藻糖基转移酶的所有等位基因被敲除，所述工程细胞用于表达无岩藻糖的抗体。本发明专利技术工程细胞所表达的抗体比其亲代细胞产生的抗体组合物具有更高的ADCC活性，其所表达的CD20抗体具有更高的抗肿瘤活性。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种，所述工程细胞的基因组中编码糖链修饰相关酶α?1，6?岩藻糖基转移酶的所有等位基因被敲除，所述工程细胞用于表达无岩藻糖的抗体。本专利技术工程细胞所表达的抗体比其亲代细胞产生的抗体组合物具有更高的ADCC活性，其所表达的CD20抗体具有更高的抗肿瘤活性。【专利说明】
本专利技术涉及一种，具体涉及一种基因组突变的工程细胞及 其应用。
技术介绍
近年来利用单克隆抗体（mAbs)治疗癌症取得了相当大的成功。抗体药物偶联抗 癌药成为了淋巴瘤和实体瘤强有力的新治疗选择，免疫调节抗体近来也取得了显著的临床 成效。 抗体导致肿瘤细胞杀伤的机制主要可概括为如下两种：①抗体直接作用于靶点， 阻断受体介导的信号转导从而诱导细胞凋亡；②抗体通过免疫介导的细胞杀伤机制，包括 例如抗体依赖性细胞毒性（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)和 补体依赖性细胞毒性反应（complement-dependent cytotoxicity，Q)C);③调节T细胞的 抗肿瘤免疫功能；④抗体对肿瘤血管和基质的特异性效应。主要通过终止肿瘤细胞信号转 导而发挥抗肿瘤作用的抗体有西妥昔单抗（cetuximab)和曲妥珠单抗（trastuzumab)等， 主要通过ADCC而发挥抗肿瘤作用的抗体有利妥昔单抗（rituximab);调节T细胞免疫功能 的抗肿瘤抗体有易普利姆玛单抗（ipilimumab)等，以上是最成功的策略，利用这些机制发 挥作用的抗体均获得了批准。 ADCC是指表达抗体Fc受体（如Fc y RIIIa/CD16)的自然杀伤细胞（natrual killer，NK)、巨噬细胞或中性粒细胞等，通过Fc受体与已结合在病毒感染细胞或肿瘤细胞 等靶细胞表面的IgG抗体的Fc段结合，从而与靶细胞发生多重交联，进而活化并杀伤这些 靶细胞的作用。IgG抗体可介导这些细胞发挥ADCC作用，其中NK细胞是能发挥ADCC作用 的主要细胞。在抗体介导的ADCC作用的发生过程中，抗体只能与靶细胞上的相应抗原表位 特异性结合，而NK细胞等效应细胞可杀伤任何已与抗体结合的靶细胞，故抗体与靶细胞上 的抗原结合是特异性的，NK细胞等对靶细胞的杀伤作用是非特异性的。ADCC是利用抗体介 导药物杀伤靶癌细胞的理想机制。活化的NK细胞能释放穿孔素、颗粒酶等细胞毒物质直接 杀伤靶细胞，也能够通过Fas与FasL作用途径诱导细胞凋亡，还可以分泌一些细胞因子如 TNF-a或IFN-y等诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖并发挥免疫调控作用。 糖基化是最重要的一种翻译后修饰，指的是将糖基部分连接到蛋白质上。翻译 后修饰对抗体的分泌表达是非常重要的，而糖基化修饰又是其中最重要的一环，单克隆抗 体的糖基化修饰影响其在体内的功能和稳定性，而抗体的糖基化修饰直接受到表达宿主细 胞和抗体分子本身性质的影响。糖基化模式的改变对免疫原性和整体生物活性有很大影 响。抗体分子Fc段特定Asn上的寡糖链参与Fc与其受体的相互作用，进一步研究还发现 寡糖链的类型对于Fc与其受体的亲合力有重要影响。近些年来，很多研究报告表明，去除 或降低岩藻糖基化的治疗性抗体在体外表现出更高的效能（Biotechnol Bioeng. 2006Jul 5 ;94(4) :680-8.)。这主要是由于去除或降低岩藻糖基化的治疗性抗体相对于岩藻糖基化 的抗体，可以在更低浓度下通过与Fey Rllla的高亲和力而表现出较强的ADCC作用（Mol Immunol. 2007May ;44(12) :3122-31.)。因此，去除或降低岩藻糖基化抗体的应用有望成为 提高下一代治疗性抗体效能的有效手段。因此，研究出能生产无岩藻糖基化抗体的工程细 胞株是本领域的技术人员急待解决的问题。 抗体分子Fc段N-糖苷连接糖链的合成如下所述：糖蛋白在内质网（以后称为 "ER"）腔中用糖链进行修饰。在N-糖苷连接糖链的生物合成步骤中，相对大的糖链被转移 至在ER腔中延伸的多肽链上。在转变过程中，糖链首先连续加入到由大约20个a -异戊二 烯单位组成的长链脂质载体的磷酸基团上，称为磷酸多萜醇（此后有时称为"P-Dol")。即， N-乙酰氨基葡萄糖被转移至磷酸多萜醇形成GlcNAc-P-P-Dol，然后转移又一个GlcNAc，从 而形成GlcNAc-GlcNAc-P-P-Dol。下一步，5个甘露糖（此后有时甘露糖被称为"Man"）被 转移，因此形成（Man)5-(GlcNAc)2-P-P-D 〇l，然后四个Man和三个葡萄糖（此后葡萄糖有时 被称为"Glc"）被转移。因此，形成了糖链前体，（Gl C)3-(Man)9-(GlcNAC)2-P-P-D〇M：a^ 形成了核心寡糖。含有14个糖的糖链前体被作为一个团体转移至内质网腔中含有天冬酰 胺-X-丝氨酸或天冬酰胺-X-苏氨酸序列的多肽上。在反应中，结合至核心寡糖上的磷酸多 萜醇（P-P-Dol)被释放，但通过焦磷酸酶的水解作用再次成为磷酸多萜醇，并再进行循环。 在糖链与多肽结合后立即开始糖链的加工。即，三个Glc和一个或两个Man在内质网上被 删除，已知a-1，2-葡萄糖苷酶I，a-1，3-葡萄糖苷酶II和a-1，2-甘露糖苷酶与删除作 用有关。在内质网上被加工的糖蛋白被转移至尚尔基体上，被进彳丁不同的修饰。在尚尔基 体腔cis部分，存在有关添加甘露糖磷酸的N-乙酰氨基葡萄糖磷酸转移酶，N-乙酰氨基葡 萄糖1-磷酸二酯a -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和a -甘露糖苷酶I，并将Man残基还原至5。 在高尔基体的中间部分，存在涉及在复合物型N-糖苷连接糖链的外侧第一个GlcNAc的添 加的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I (GnTI)，涉及删除两个Man的a -甘露糖苷酶II，涉及从 外侧添加第二个GlcNAc的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶II (GnTII)和涉及岩藻糖添加至还 原末端的N-乙酰氨基葡萄糖上的a-1，6-岩藻糖基转移酶（编码基因为FUT8)。在高尔基 体的trans部分，存在与半乳糖的添加有关的半乳糖转移酶和与唾液酸如N-乙酰神经氨酸 的添加有关的唾液酸转移酶或类似物。已知N-糖苷连接糖链是通过这些不同酶的作用形 成的。 TALENs技术已被广泛地用于基因组定点修饰。但是目前为止，无论是ZNFs还 是TALENs的筛选以及组装过程都存在着较高的技术难度，并且筛选的工作量很大。此 外，TALENs潜在的细胞毒性问题仍有待人们进行深入的研究。Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR associated(Cas)系统 是继锌指核酸酶（zinc finger nucleases，ZNFs)及转录激活因子样效应物核酸酶 (transcription activator like effector nucleases，TALENs)技术之后一种新的对基因 组进行高效定点修饰的技术。这种系统是细菌以及古细菌在进化过程中形成的可以降解外 来病毒或核酸的具有免疫以及调节功能的系统（Science 327, 167(2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因工程细胞，其特征在于：所述细胞的基因组中编码糖链修饰相关酶α‑1，6‑岩藻糖基转移酶的所有等位基因被敲除；所述糖链中岩藻糖的1位与N‑糖苷连接的糖链复合体中还原端的N‑乙酰氨基葡萄糖的6位通过α‑键连接。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵杰，张成海，朱玲巧，
申请(专利权)人：三生国健药业上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31