本发明专利技术涉及生物医学领域，具体地说是涉及一种α（１，３）半乳糖转移酶表达载体，特征是能够高效感染人的各种肿瘤细胞，使之表达α（１，３）半乳糖转移酶，引起肿瘤细胞表面表达α－Ｇａｌ半乳糖表位，同时增加肿瘤特异性抗原表位的暴露，引起免疫排斥反应，预防或／和治疗肿瘤等新生物。制备方法主要应用基因克隆，表达，纯化，重组等基因工程和细胞工程技术。这种载体可以用于人类多种疾病的基因治疗以及免疫治疗，能有效治疗或／和预防人类多种肿瘤等新生物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学领域，具体地说是涉及一种α(1，3)半乳糖转移酶表达载体，特征是能够高效感染人的各种肿瘤细胞，使之表达α(1，3)半乳糖转移酶，引起肿瘤细胞表面表达α-Gal半乳糖表位，同时增加肿瘤特异性抗原表位的暴露，引起免疫排斥反应，预防或/和治疗肿瘤等新生物。制备方法主要应用基因克隆，表达，纯化，重组等基因工程和细胞工程技术。这种载体可以用于人类多种疾病的基因治疗以及免疫治疗，能有效治疗或/和预防人类多种肿瘤等新生物。
技术介绍
随着分子生物学技术的进步，特别是基因工程和细胞工程技术的发展，肿瘤等新生物的基因治疗成为人们研究的热点。目前，全球共有600多项基因治疗方案获准进入临床实验，有些治疗方案已获得一定疗效，初步显示了基因治疗的前景。作为可用于基因治疗的各种载体，本身不具有任何治疗疾病的意义，无临床应用价值；而作为可用于各种治疗的目的基因，由于直接导入靶细胞及其在靶细胞内直接表达的有一定难度，只具有潜在的治疗作用，没有实际的临床价值。只有将具有潜在治疗作用的基因与可转移基因的载体结合，通过后者介导，将目的基因导入靶细胞并表达，才能达到真正的临床治疗效果。因此，构建治疗基因与基因载体的融合序列是实现基因治疗的关键。将目的基因的表达盒与载体进行融合常用的方法是在真核细胞中进行同源重组，过程复杂，费时费力，而使用在原核细胞(大肠杆菌)中实现同源重组、构建融合表达载体的基因工程技术则可有效解决上述问题。缺乏特异性，靶向性及高效性的基因转移载体一直是肿瘤基因治疗的一个难题，目前，用于基因治疗的载体主要分为病毒载体和非病毒载体两大类。常用的病毒载体有腺病毒载体，腺相关病毒载体和逆转录病毒载体等。腺病毒载体是常用的基因载体，它的优点在于转染效率高、可操作性好、能携带较大的目的基因片断、可制备高效价的病毒颗粒，易于工业化生产，即能感染分裂期细胞，也能感染非分裂期细胞，具有安全、致病性低等优点。也有不足之处，一是感染缺乏特异性，二是具有免疫原性。因此，对腺病毒载体进行存利去弊的改进是发展基因治疗的必由之路。研究表明，腺病毒载体E1或E3缺失区携带外源性基因整合进靶细胞基因组中实现目的基因的较长时间的表达，且可降低其免疫源性，逆转录病毒载体能携带外源基因整合进靶细胞基因组中实现目的基因稳定持久的表达，但逆转录病毒体外繁殖滴度低、转染效率低，只感染分裂期细胞，在染色体里是随机整合；其他可用于基因转移的病毒载体和非病毒载体均存在不同的利弊。大量证据提示人体内存在预先形成的抗体，即天然抗体(NAb)，是种间移植存在超急排斥现象(HAR)的基础。HAR中的人的天然抗体可以广泛识别猪抗原，但实际上，90％以上人血清内的补体依赖性排异反应天然抗体只识别异种(猪)抗原的一个结构，即α(1，3)半乳糖基(gal)，它是异种(猪)抗原的抗原表位(决定簇)，这些抗原都特异性地携带一个α(1，3)半乳糖基抗原表位。α(1，3)半乳糖基的形成，主要由α(1，3)半乳糖转移酶催化，这种酶在低等动物和新世界猴体内表达，人、猿、及旧世界猴体内都缺乏这种酶。由于人体不表达α(1，3)半乳糖转移酶，也不携带α(1，3)半乳糖的抗原表位(决定簇)，因此频繁地与该抗原接触使得体内的天然抗体有很高的效价。人细胞，特别是肿瘤细胞，引入异种(猪)的α(1，3)半乳糖转移酶基因，使之表达α(1，3)半乳糖转移酶，引起肿瘤细胞表面大量表达半乳糖表位，半乳糖表位引发了人体内的天然抗体对肿瘤细胞产生补体介导的细胞毒作用，进而肿瘤特异性抗原的暴露引发特异性免疫反应，达到治疗或/和预防肿瘤的目的。这种方法充分利用体内存在的天然抗体，是一种简便，经济的基因治疗或/和免疫治疗方案。
技术实现思路
本专利技术旨在将具有潜在治疗作用的基因与可转移基因的载体进行有机结合，而提供一种病毒载体与α(1，3)半乳糖转移酶基因的重组载体，能够在基因工程改造过的特定细胞中繁殖、生产，并可在真核细胞中表达，使肿瘤细胞膜表面产生较多α(1，3)半乳糖基表位，用于人类多种疾病的基因治疗以及免疫治疗。结果令人鼓舞，细胞感染α(1，3)半乳糖转移酶基因的重组病毒体后，细胞表面产生较多半乳糖表位，引发了人体内的天然抗体对肿瘤细胞产生补体介导的细胞毒作用以及肿瘤特异性抗原的暴露引发的特异性免疫反应，达到了治疗或/和预防肿瘤的目的。本专利技术的目的还在于提供重组载体的制备方法及其用于制备治疗或/和预防肿瘤药物的方法。为实现上述目的，本专利技术提供一种病毒载体与α(1，3)半乳糖转移酶基因的重组载体，该重组载体是将由DNA克隆技术构建的病毒载体与α(1，3)半乳糖转移酶基因表达盒相结合，构建成一个能在基因工程改造过的特定细胞中扩增、繁殖，也能在真核细胞中表达α(1，3)半乳糖转移酶的融合序列。该重组载体的载体可以为质粒载体，DNA病毒或RNA病毒载体的任何一种，其优选载体为腺病毒载体或含有腺病毒载体序列的复合载体；最优选载体为腺病毒载体。所述α(1，3)半乳糖转移酶基因可以是α(1，3)半乳糖转移酶基因的任一种，最优选的基因为猪α(1，3)半乳糖转移酶基因。本项专利技术提供了这种重组载体的制备和应用方法一、重组α(1，3)半乳糖转移酶基因重组载体和/或重组腺病毒颗粒的制备方法 提供了一种用分子生物学中基因克隆，表达，纯化，重组等基因工程和细胞工程技术制备重组载体的方法。该重组载体的载体可以为DNA病毒或RNA病毒的任一种，其优选载体为腺病毒载体或含有腺病毒载体序列的复合载体；最优选载体为腺病毒载体。这种方法在载体中引入α(1，3)半乳糖转移酶基因，组成转染效率高、可操作性强的重组α(1，3)半乳糖转移酶基因重组腺病毒载体和/或重组腺病毒颗粒。二、重组载体或病毒体的应用方法 此项专利技术提供了应用上述重组病毒体进行肿瘤等新生物治疗或/和预防的方法。本专利技术的重组载体或病毒体可用于制备成合适的剂型，如液体剂型、半固体剂型、固体型或气体剂型。本专利技术的重组载体中治疗基因的启动子可以替换为人体器官特异性启动子，达到靶向性治疗的目的。本专利技术的重组载体可用于对肿瘤细胞进行免疫修饰，制成肿瘤疫苗预防肿瘤。下面结合具体实施方式对本专利技术做进一步说明，凡依照本专利技术公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本专利技术的保护范围。具体实施例方式实施例1例如，猪的重组α(1，3)半乳糖转移酶基因腺病毒体(颗粒)这样准备(a)在腺病毒载体(如pShuttle)序列中，定点引入猪的α(1，3)半乳糖转移酶的cDNA，组成α(1，3)半乳糖转移酶基因腺病毒穿梭载体；(b)将(a)中α(1，3)半乳糖转移酶基因腺病毒穿梭载体转入原核细胞(如BJ5183-AD-1)中筛选，挑取阳性克隆，酶切以及测序确定正确阳性克隆，并进行扩增获取重组载体DNA；(c)将(b)中扩增的重组载体DNA转入包装细胞(如Ad-293)，产出适量猪的α(1，3)半乳糖转移酶基因的腺病毒体(复制缺陷的病毒颗粒)；(d)将上述病毒颗粒纯化制备成制剂，如液体剂型、半固体剂型、固体型或气体剂型。实施例2例如，猪的重组α(1，3)半乳糖转移酶基因腺病毒体治疗尖锐湿疣这样实施(a)猪的重组α(1，3)半乳糖转移酶基因腺病毒体制备成质量符合临床试验标准的半固体制剂；然后(b)尖锐湿疣表本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组载体，是载体基因和α（１，３）半乳糖转移酶表达编码区的重组体，通过基因工程和细胞工程方法制备，能够在靶细胞或宿主细胞中表达α（１，３）半乳糖转移酶，用于非特异性或器官特异性启动子等指导的靶向性治疗以及用于对肿瘤细胞进行免疫修饰，制成肿瘤疫苗预防肿瘤。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨捷，
申请(专利权)人：杨捷，
类型：发明
国别省市：52[中国|贵州]
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