本发明专利技术提供了在植物、植物部分或植物细胞中合成具有经修饰的N-糖基化谱的目的蛋白质的方法。所述方法包括在植物中共表达编码第一核苷酸序列和第二核苷酸序列的核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码杂合蛋白(GNT1-GalT)，所述杂合蛋白包含与β-1，4-半乳糖基转移酶(GalT)催化结构域融合的N-乙酰葡糖氨基转移酶(GNT1)CTS结构域，所述第一核苷酸序列与在所述植物中有活性的第一调节区有效连接，所述第二核苷酸序列编码目的蛋白质，所述第二核苷酸序列与在所述植物中有活性的第二调节区有效连接。将所述第一和第二核苷酸序列共表达，从而在植物、植物部分或植物细胞中合成目的蛋白质，所述目的蛋白质包含具有经修饰N-糖基化谱的聚糖。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】 本申请是申请号为200880103174. 3、专利技术名称为"修饰植物中的糖蛋白产生"的申 请的分案申请，该母案申请是2008年6月13日提交的PCT申请PCT/CA2008/001139进入 中国国家阶段的申请。
本专利技术涉及修饰植物中糖蛋白产生的方法。本专利技术还提供了具有经修饰的糖蛋白 产生的植物。 专利技术背景 免疫球蛋白（IgG)是对多种性质的特异性抗原对应物具有特征性亲和力的复合 异多亚基蛋白。目前，对IgG生产细胞系的常规分离和IgG定向进化与分子工程技术的 出现极大地影响了它们作为生物治疗剂和在一般生命科学市场中的发展。治疗性单克隆 IgG(单克隆抗体，mAb)主宰着目前的新抗炎药和抗癌药市场，并且目前有数百种新的候选 者处于针对改进应用或新应用的研宄和临床开发中。每年的mAb市场需求从数克（诊断 学）、数千克（抗毒素）到多达一百或数百千克（生物防御、抗癌、抗感染、抗炎药）。 尽管CH0细胞培养物仍然是它们优选的商业规模生产宿主，但目前公认的是，为 了让mAb在生命科学市场中完全发挥作用，必须开发替代性的生产系统，因为这些培养物 需要的设备不容易大规模调控，它们的建造和维护成本极高并且逐渐提高，而且其GMP认 证在建设后仍然平均需要三年。即便是在早期开发阶段，对具有可接受的产率和生产力的 CH0细胞系的选择仍然是一个昂贵和长期的过程。会降低上游成本（更高的产率、更简单的 技术和基础设施），具有更短的前导时间、在容量方面更加灵活而同时满足现有细胞培养系 统目前的生产力、品质和安全特性的新生产系统很可能在每个开发阶段对用于生命科学市 场之mAb和疫苗的开发具有重大影响。 对mAb和目前应用于生命科学中的若干其他蛋白质的生产而言，植物是合适的宿 主（近期综述见Ko和Koprowski2005 ;Ma等，2005 ;Yusibov等，2006)。MAb已在稳定的转 基因植物株系中以多达200mg/kg鲜重（FW)的产量生产，并且通过瞬时表达以多达20mg/kg FW的产量生产（Kathuria，2002)。Giritch等（2006)报道了对IgG而言 200-300mg/kg叶 重量的表达水平，其中一个列举的最大值为500mg/kg，其通过使用基于多病毒的瞬时表达 系统获得。 植物和哺乳动物N-糖基化过程有差异。哺乳动物中N-糖基化的较后步骤为向复 合聚糖上添加0 1，4半乳糖、a1，6岩藻糖（0 -1，4半乳糖、a-1，6岩藻糖）和末端唾液酸 残基。然而在植物中添加的是0 1，3半乳糖、a1，3岩藻糖（0-1，3半乳糖、a-1，3岩藻 糖），a1，4岩藻糖和M，2木糖（a_1，4岩藻糖和0-1，2木糖）残基。a1，3-岩藻糖和 0 1，2木糖是一些植物变应原的糖表位组分，这些残基被认为可能是免疫原性的，并且不期 望它们出现在治疗性蛋白质（包括抗体）上。 对肽的C端添加KDEL序列通常被用于确保肽从高尔基体上回收至ER。该方法 被用于使用烟草叶的农杆菌渗入法生产非岩藻糖基化和非木糖基化的抗体（Sriraman等， 2004)。然而，所添加的KDEL肽可能是免疫原性的，并且该方法对于生产治疗性蛋白质的适 用性有限。 还通过修饰岩藻糖基转移酶和木糖基转移酶的表达，实现了对a1，3岩藻糖 (a-1，3岩藻糖）和|3 1，2木糖（0 _1，2木糖）添加的控制。在苔藓（Physcomitrella patens;Koprivova等，2〇04)和拟南芥（Arabidopsisthaliana)(Strasser等，2〇04) 中产生了不能在复合聚糖上添加a1，3岩藻糖和M，2木糖的突变体。还通过在浮萍 (Lemnaminor)中表达革E1向al，3岩藻糖基转移酶和0 1，2木糖木糖基转移酶基因的干 扰RNA(RNAi)，实现了对植物岩藻糖基转移酶和木糖基转移酶表达的部分抑制（Cox等， 2004)。然而，这些酶活性的完全抑制对若干植物物种具有有害影响，因为它们干扰关键的 发育事件，例如花粉形成或结籽。RNAi诱导的mRNA特异性降解可能不是随时间稳定的，并 且可能不适合用于生产治疗性药物的多种基于植物的平台，因为其被报道为对环境因素敏 感。W0 03/078637公开了人半乳糖基转移酶催化植物聚糖上添加末端M，4半乳糖 (GalT)的用途。通过使用与木糖基转移酶跨膜结构域的融合物得到的GalT表达并将其活 性靶向顺面高尔基体导致末端半乳糖的添加和带有植物特异性残基的N-聚糖的减少（还 见Bakker等，2006)。将这些植物与含有重组IgG的植物育种，导致含有岩藻糖和木糖的聚 糖的显著但不定量的减少。 通过N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnT-III;EC2. 4. 1. 144)催化将0-1，4_连接 的N-乙酰葡糖胺（GlnNAc)残基与0-连接的甘露糖结合，产生平分（bisected)的GlcNac。 已描述了将该酶引入植物中（Rouwendal等，2007)，并且植物表达的包含GnT-III的、具有 复合N-聚糖的蛋白质被对切并带有两个GlnAc残基。 专利技术概述 本专利技术涉及修饰植物中糖蛋白产生的方法。本专利技术还提供了具有经修饰的糖蛋白 产生的植物。 提供用于修饰植物中糖蛋白产生的改进方法是本专利技术的一个目的。 本文中提供了具有核苷酸序列（A)的核酸，所述核苷酸序列（A)包含SEQIDN0 : 17 (GNTl-GalT;图5d)的1-1077位核苷酸，或包含与SEQIDNO: 17的1-1077位核苷酸显 示约80%到100%同一性的核苷酸序列，所述同一性使用以下参数测定：程序：blastn;数 据库：nr;预期10 ;过滤：低复杂度；比对：成对；字长：11，其中所述核苷酸序列编码修饰目 的蛋白质糖基化的蛋白质。 还提供了具有核苷酸序列（B)的核酸，所述核苷酸序列（B)包含第一核酸序列，所 述第一核酸序列包含SEQIDN0:14 (GalT)的5-1198位核苷酸，或包含与SEQIDN0:14的 5-1198位核苷酸显示约80%到100%同一性的序列，所述同一性使用以下参数测定：程序： blastn;数据库：nr;预期10 ;过滤：低复杂度；比对：成对；字长：11，其中所述第一核酸序 列编码修饰目的蛋白质糖基化的蛋白质，所述第一核酸序列与包含35S启动子或质体蓝素 启动子的第二核酸序列有效连接。本专利技术描述了具有下述核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列包含SEQIDN0: 26(GNTl-GnT-III)的1-1641位核苷酸，或包含与SEQIDNO:26的1-1641位核苷酸显示 约80%到100%同一性的核苷酸序列，所述同一性使用以下参数测定：程序：blastn;数据 库：nr;预期10 ;过滤：低复杂度；比对：成对；字长：11，其中所述核苷酸序列编码修饰目的 蛋白质糖基化的蛋白质。 还描述了具有下述核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列包含第一核酸序列，所述 第一核酸序列包含SEQIDN0:16(GnT-III)的1-1460位核苷酸，或包含与SEQIDN0: 16的1-1460位核苷酸约80%到100%相似的序列，所述相似性使用以下参数测定：程序： blastn;数据库：nr本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于合成具有修饰的N‑糖基化谱之目的蛋白质的方法，其包括：在植物、植物部分或植物细胞中共表达核苷酸序列，所述核苷酸序列编码第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码杂合蛋白GNT1‑GalT，所述杂合蛋白包含与β‑1，4‑半乳糖基转移酶(GalT)催化结构域融合的N‑乙酰葡糖氨基转移酶(GNT1)CTS结构域，所述第一核苷酸序列与在所述植物中有活性的第一调节区有效连接，所述第二核苷酸序列编码目的蛋白质，所述第二核苷酸序列与在所述植物中有活性的第二调节区有效连接；共表达所述第一和第二核苷酸序列，从而合成目的蛋白质，其包含具有修饰的N‑糖基化谱的聚糖。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：马克安德烈·德奥斯特，埃斯泰勒·马凯布卢安，穆里尔·巴尔多，卡罗勒·比雷尔，卢瓦克·法耶，帕特里斯·勒鲁热，路易斯菲利普·韦齐纳，韦罗妮克·戈莫尔德，斯特凡妮·阿奎，克里斯托夫·里韦，托马斯·帕卡莱特，克里斯托夫·苏鲁耶，
申请(专利权)人：麦迪卡格公司，国家科学研究中心，鲁昂大学，
类型：发明
国别省市：加拿大;CA
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