流感病毒血凝素突变体制造技术

本发明专利技术涉及在植物中产生经过修饰的流感病毒蛋白。更具体地说，本发明专利技术涉及在植物中产生流感病毒样微粒(VLP)和增加其产量，其中VLP包括经过修饰的流感病毒蛋白，例如经过修饰的流感病毒血凝素(HA)。该HA蛋白可包括与相应的野生型氨基酸序列相比包含至少一个取代的氨基酸序列。还提供了一种对经过修饰的HA蛋白进行编码的核酸。此外，还提供了在植物、植物部分或植物细胞中产生流感病毒样微粒(VLP)的方法和增加植物、植物部分或植物细胞中的流感病毒样微粒(VLP)的产量的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】流感病毒血凝素突变体
本专利技术涉及在植物中产生突变型病毒蛋白。更具体地说，本专利技术涉及在植物中产生流感病毒样微粒和增加流感病毒样微粒的产量。
技术介绍
流感病毒是正粘病毒科的包膜单链核糖核酸病毒。流感病毒具有高度传染性，可能在所有年龄群体中引起轻度至重度的疾病。接种疫苗仍然是预防流感传染的最有效方法。传统上，疫苗接种是使用减毒活病毒或完全灭活的病毒完成的，这在向患者给药时会引发免疫应答。为了消除减毒活病毒和完全灭活的病毒重新获得复制和感染能力的潜在风险，还使用包括重组病毒蛋白的疫苗来引发对流感传染的保护性免疫。但是，使用重组病毒蛋白作为疫苗的免疫原性成分受到许多限制。首先，在没有最佳表达和适当蛋白折叠所需的一整套病毒蛋白和遗传成分的情况下，标准体外表达系统中的重组病毒蛋白的产量可能不足以用于疫苗生产的目的。其次，由于折叠不当、抗原呈递不良和/或在赋予持久的保护性免疫方面无效的主要体液免疫应答的产生，重组病毒蛋白疫苗可能表现出较差的免疫原性。有四种类型的流感病毒：甲型、乙型、丙型和丁型，其中甲型和乙型流感病毒是人群中的季节性疾病流行的致病微生物。甲型流感病毒根据血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)糖蛋白亚型在病毒表面上的表达进一步划分。有18种不同的血凝素亚型(H1-H18)。血凝素是一种促进流感病毒微粒与含唾液酸蛋白在靶细胞表面上的结合并介导病毒基因组向靶细胞中的释放的三聚体凝集素。血凝素蛋白包括两个结构元件：头部，它是血清保护性抗体的主要靶标；以及柄部。血凝素被转译为单个多肽HA0(组装为三聚体)，该多肽HA0必须被丝氨酸内切蛋白酶在HA1(大约40kDa)子域与HA2(大约20kDa)子域之间切开。在切割后，两个二硫键结合的蛋白质结构域采用实现病毒传染性所需的必要构象。HA1形成包括受体结合位点(RBS)的球状头部结构域，并且是流感病毒的最不保守的片段。HA2是一种具有融合肽(FP)、可溶性胞外结构域(SE)、跨膜结构域(TM)和细胞质尾部结构域(CT)的单向膜内在蛋白质，这些结构域的相应长度大约为25、160、25和10个残基。HA2与氮和碳末端HA1残基共同形成柄结构域，该结构域包括跨膜结构域，并且是相对保守的。已经研究了流感病毒蛋白(尤其是流感病毒血凝素蛋白)的各种突变。例如，Castelán-Vega等人(AdvApplBioinformChem.2014；7：37-44)使用稳定性预测算法来比较来自甲型流感病毒(H1N1)pdm09的血凝素的7479个全长氨基酸序列，并确定D104N、A259T、S124N和E172K突变导致预测的流感病毒血凝素蛋白稳定性增强。相反，S206T、K285E和E47K突变对血凝素有预测的破坏稳定作用。在比较最初的甲型病毒(H1N1)pdm[A/California/7/2009]和后来出现的流感毒株[A/Brisbane/10/2010]的序列时，Cotter等人(PLoSPathog.2014；10(1)：e1003831)确定A/California/7/2009血凝素的柄结构域中的E47K突变能稳定三聚体结构，降低膜融合的pH值，并提高病毒的热和酸稳定性。Cotter等人还观察到，A/California/7/2009E47K突变体血凝素在雪貂中比其野生型对应物更具传染性。Antanasijevic等人(JBiolChem.2014；289(32)：22237-45)通过在14个不同位置处的定点诱变研究了H5血凝素的茎环结构域的结构-功能特性。使A/Vietnam/1203/04(H5N1)突变体在HEK293T细胞中表达，并且Antanasijevic报告说，茎环结构域中的大多数突变不会破坏表达、蛋白酶解加工、病毒组装或受体结合。但是，Antanasijevic观察到HA1-D26K、HA1-M102L、HA2-V52A和HA2-I55A突变体(基于H3编号)表现出显著降低的总血凝素水平，这表明血凝素在病毒微粒中的表达和/或组装减少。与野生型病毒相比，HA1-D26K、HA2-T49A和HA2-M102L突变体还表现出较低的血凝效价。Antanasijevic还观察到，所有的单突变体进入A549肺细胞的能力降低，其中HA1-D26K和HA2-I55A突变体的削弱最明显。Antanasijivec还证明，与野生型病毒相比，HA2-L99A突变体对于C179中和抗体对A549肺细胞的抑制更敏感，这表明该突变增强了抗体结合和/或中和作用的模式。相反，HA1-I28A、HA1-M31A、HA1-M31L、HA2-I45A和HA2-I55V突变体对于由C179中和抗体造成的进入抑制不太敏感。Lu等人的WO2013/177444及其配套文献(ProcNatlAcadSciUSA.2014；111(1)：125-30)报告了一种使用基于大肠杆菌的无细胞蛋白质表达系统和简单的重折叠方案从A/California/05/2009(H1N1)产生正确折叠的血凝素茎结构域的方法。为了诱导血凝素茎结构域的三聚化，将氯霉素乙酰转移酶(CAT)或折叠结构域融合到血凝素的碳末端上。为了减轻新暴露的疏水性和/或导致表达的血凝素茎蛋白聚集的分子间离子配对，评估了五组突变：M1(I69T+I72E+I74T+C77T)；M2(I69T+I72E+I74T+C77T+F164D)；M3(I69T+I72E+I74T+C77T+F164D+L174D)；M4(F164D)；以及M5(F164D+L174D)。Lu观察到，M5(F164D+L174D)突变似乎是对提高血凝素茎蛋白溶解度影响最大的突变。对M5突变体进行了附加的删除(H38至C43和C49至N61)和C77T突变，以免形成不希望有的二硫键，降低表面疏水性和pI，并避免具有无序结构的区域。霍尔茨等人的美国申请13/838,796及其配套文献(BMCBiotechnology.2014；14：111)教导了通过血凝素蛋白的羧基末端结构域(包括跨膜结构域(TM)和胞质结构域(CT))中的半胱氨酸残基的突变来提高重组血凝素的稳定性和保持其效力。具体而言，霍尔茨等人证明了重组Perth/16/2009血凝素(H3N2)中的C539A、C546A、C549A、C524S和C528A突变。所有五个半胱氨酸残基或其不同子集的突变导致了与重组野生型血凝素蛋白相当的血凝素产量、纯度、微粒大小、血凝活性和热稳定性。相反，C64S和C76S突变导致血凝素表达显著降低，这表明了这些残基在血凝素正确折叠中的关键作用。通过使用单一径向免疫扩散分析(SRID)，霍尔茨等人还表明，与野生型蛋白相比，这五种半胱氨酸残基的突变通过防止TM和CT结构域中的二硫键交联而提高了重组血凝素的效力。突变型血凝素蛋白在25℃温度下能保持效力至少12个月，而野生型血凝素蛋白在纯化后仅经过50天就表现出效力低于40％。WO2015/020913教导了位于选自流感病毒A/PuertoRico/8/1934(H1N1)的一组位置403、4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸，包括对经过修饰的流感病毒H3血凝素(HA)蛋白进行编码的核苷酸序列，所述血凝素蛋白包括氨基酸序列，所述氨基酸序列与相应的野生型氨基酸序列相比包括至少一个取代，所述至少一个取代位于与A/Hong Kong/4801/14血凝素的位置382、384、392、431、524、525、526或528处的氨基酸对应的一个或多个氨基酸处。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180627 US 62/690,7801.一种核酸，包括对经过修饰的流感病毒H3血凝素(HA)蛋白进行编码的核苷酸序列，所述血凝素蛋白包括氨基酸序列，所述氨基酸序列与相应的野生型氨基酸序列相比包括至少一个取代，所述至少一个取代位于与A/HongKong/4801/14血凝素的位置382、384、392、431、524、525、526或528处的氨基酸对应的一个或多个氨基酸处。


2.根据权利要求1所述的核酸，包括：
位于与A/HongKong/4801/14血凝素的位置382处的氨基酸对应的所述氨基酸处的第一个取代，所述取代为非天冬酰胺取代，
位于与A/HongKong/4801/14血凝素的位置524处的氨基酸对应的所述氨基酸处的第二个取代，所述取代为非半胱氨酸取代，以及
位于与A/HongKong/4801/14血凝素的位置528处的氨基酸对应的所述氨基酸处的第三个取代，所述取代为非半胱氨酸取代。


3.根据权利要求2所述的核酸，其中：
所述第一个取代为丙氨酸取代，或者是保守的丙氨酸取代，
所述第二个取代为丝氨酸取代，或者是保守的丝氨酸取代，并且
所述第三个取代为亮氨酸取代，或者是保守的亮氨酸取代。


4.根据权利要求1所述的核酸，包括：
位于与A/HongKong/4801/14血凝素的位置384处的氨基酸对应的所述氨基酸处的第一个取代，所述取代为非亮氨酸取代，
位于与A/HongKong/4801/14血凝素的位置524处的氨基酸对应的所述氨基酸处的第二个取代，所述取代为非半胱氨酸取代，以及
位于与A/HongKong/4801/14血凝素的位置528处的氨基酸对应的所述氨基酸处的第三个取代，所述取代为非半胱氨酸取代。


5.根据权利要求4所述的核酸，其中：
所述第一个取代为缬氨酸取代，或者是保守的缬氨酸取代，
所述第二个取代为丝氨酸取代，或者是保守的丝氨酸取代，并且
所述第三个取代为亮氨酸取代，或者是保守的亮氨酸取代。


6.根据权利要求1所述的核酸，包括：
位于与A/HongKong/4801/14血凝素的位置392处的氨基酸对应的所述氨基酸处的第一个取代，所述取代为非苯丙氨酸取代，
位于与A/HongKong/4801/14血凝素的位置524处的氨基酸对应的所述氨基酸处的第二个取代，所述取代为非半胱氨酸取代，以及
位于与A/HongKong/4801/14血凝素的位点528处的氨基酸对应的所述氨基酸处的第三个取代，所述取代为非半胱氨酸取代。


7.根据权利要求6所述的核酸，其中：
所述第一个取代为天冬氨酸取代，或者是保守的天冬氨酸取代，
所述第二个取代为丝氨酸取代，或者是保守的丝氨酸取代，并且
所述第三个取代为亮氨酸取代，或者是保守的亮氨酸取代。


8.根据权利要求1所述的核酸，包括：
位于与A/HongKong/4801/14血凝素的位置431处的氨基酸对应的所述氨基酸处的第一个取代，所述取代为非亮氨酸取代，
位于与A/HongKong/4801/14血凝素的位置524处的氨基酸对应的所述氨基酸处的第二个取代，所述取代为非半胱氨酸取代，以及
位于与A/HongKong/4801/14血凝素的位置528处的氨基酸对应的所述氨基酸处的第三个取代，所述取代为非半胱氨酸取代。


9.根据权利要求8所述的核酸，其中：
所述第一个取代为蛋氨酸取代，或者是保守的蛋氨酸取代，
所述第二个取代为丝氨酸取代，或者是保守的丝氨酸取代，并且
所述第三个取代为亮氨酸取代，或者是保守的亮氨酸取代。


10.根据权利要求1所述的核酸，包括：
位于与A/HongKong/4801/14血凝素的位置382处的氨基酸对应的所述氨基酸处的第一个取代，所述取代为非天冬酰胺取代，
位于与A/HongKong/4801/14血凝素的位置384处的氨基酸对应的所述氨基酸处的第二个取代，所述取代为非亮氨酸取代，
位于与A/HongKong/4801/14血凝素的位置524处的氨基酸对应的所述氨基酸处的第三个取代，所述取代为非半胱氨酸取代，以及
位于与A/HongKong/4801/14血凝素的位置528处的氨基酸对应的所述氨基酸处的第四个取代，所述取代为非半胱氨酸取代。


11.根据权利要求10所述的核酸，其中：
所述第一个取代为丙氨酸取代，或者是保守的丙氨酸取代，
所述第二个取代为缬氨酸取代，或者是保守的缬氨酸取代，
所述第三个取代为丝氨酸取代，或者是保守的丝氨酸取代，并且
所述第四个取代为亮氨酸取代，或者是保守的亮氨酸取代。


12.根据权利要求1至11中任一项所述的核酸，所述血凝素蛋白还包括位于与A/HongKong/4801/14HA的位置525或526或位置525及526处的氨基酸对应的氨基酸处的取代，其中位置525处的氨基酸的所述取代为非苯丙氨酸取代，并且位置526处的氨基酸的所述取代为非亮氨酸取代。


13.根据权利要求12所述的核酸，其中位置525处的氨基酸的所述取代为亮氨酸取代，或者是保守的亮氨酸取代，并且位置526处的氨基酸的所述取代为缬氨酸取代，或者是保守的缬...

【专利技术属性】
技术研发人员：皮尔奥利弗·拉沃伊，奥雷连·洛瑞，阿兰·道赛特，马克安德鲁·德奥斯特，玛南·科沃托，
申请(专利权)人：麦迪卡格公司，
类型：发明
国别省市：加拿大;CA