新酯酶及其用途制造技术

本发明专利技术涉及新酯酶，更特别地涉及与SEQ ID N°1的酯酶相比具有改进的活性和/或改进的热稳定性的酯酶变体及其在降解含聚酯材料如塑料制品中的用途。本发明专利技术的酯酶特别适合于降解聚对苯二甲酸乙二醇酯和含聚对苯二甲酸乙二醇酯的材料。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新酯酶及其用途相关申请本专利技术涉及新酯酶，更特别地涉及与亲本酯酶相比具有改进的活性和/或改进的热稳定性的酯酶。本专利技术还涉及所述新酯酶用于降解含聚酯材料(如塑料制品)的用途。本专利技术的酯酶特别适用于降解聚对苯二甲酸乙二醇酯和含有聚对苯二甲酸乙二醇酯的材料。
技术介绍
酯酶能够催化各种聚合物(包括聚酯)的水解。在这种情况下，酯酶已经在许多工业应用中显示出有希望的效果，包括作为洗碗和洗衣应用的洗涤剂、作为用于处理生物质和食品的降解酶、作为环境污染物去毒中的生物催化剂或用于处理纺织工业中的聚酯织物。使用酯酶作为降解酶来水解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)是特别令人感兴趣的。实际上，PET用于众多
，例如用于制造服饰、地毯或以热固性树脂形式用于制造包装材料或汽车塑料制品等，从而填埋场中的PET积累变成与日俱增的生态问题。聚酯(特别是PET)的酶促降解被认为是减少这种塑料废物积累的令人感兴趣的解决方案。实际上，酶可以加速含聚酯材料(更特别是塑料制品)的水解，甚至达到单体水平。此外，水解产物(即单体和低聚物)可以作为合成新聚合物的材料再循环。在这种情况下，已经鉴定了几种酯酶作为用于聚酯的候选降解酶，并且已经开发了这种酯酶的一些变体。在酯酶中，角质酶，也称为角质水解酶(EC3.1.1.74)，是特别令人感兴趣的。已经从各种真菌(P.E.Kolattukudyin"Lipases"，Ed.B.Borg-strómandH.L.Brockman、Elsevier1984、471-504)、细菌和植物花粉中鉴定了角质酶。最近，宏基因组学途径已经鉴定了其他酯酶。但是，仍然需要与已知酯酶相比具有改进的活性和/或改进的热稳定性的酯酶，以提供更有效的聚酯降解方法，从而更具竞争力。专利技术概述本专利技术提供与具有SEQIDN°1所示的氨基酸序列的亲本或野生型酯酶相比，表现出增加的活性和/或增加的热稳定性的新酯酶。该野生型酯酶对应于Sulaimanetal.，ApplEnvironMicrobiol.2012Mar中描述的宏基因组衍生的角质酶的氨基酸序列的氨基酸36-293，并且在SwissProt中被称为G9BY57。本专利技术的酯酶在降解塑料制品，特别是含有PET的塑料制品的方法中特别有用。在这方面，本专利技术的一个目的是提供酯酶，其(i)与SEQIDN°1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，(ii)与氨基酸序列SEQIDN°1相比，在选自F208、D203、S248、V170、V177、T176、T61、S65或Y92的位置处包含至少四个取代，和(iii)与SEQIDN°1的酯酶相比，显示出增加的聚酯降解活性和/或增加的热稳定性。本专利技术的另一个目的是提供酯酶，其(i)与SEQIDN°1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，(ii)与氨基酸序列SEQIDN°1相比，在选自F208、D203、S248、V170、V177、T176、T61、S65、N211或Y92的位置处包含至少四个取代，和(iii)与SEQIDN°1的酯酶相比，显示出增加的聚酯降解活性和/或增加的热稳定性。优选地，酯酶至少包含位置F208+D203+S248处的取代和选自V170、V177、T176、T61、S65、N211或Y92的位置处的一个或两个取代的组合。本专利技术的另一个目的是提供编码本专利技术的酯酶的核酸。本专利技术还涉及包含所述核酸的表达盒或表达载体，并且涉及包含所述核酸、表达盒或载体的宿主细胞。本专利技术还提供包含本专利技术的酯酶、本专利技术的宿主细胞或其提取物的组合物。本专利技术的进一步目的是提供生产本专利技术酯酶的方法，其包括：(a)在适于表达编码酯酶的核酸的条件下培养根据本专利技术的宿主细胞；和任选地(b)从细胞培养物回收所述酯酶。本专利技术的进一步目的是提供降解聚酯的方法，其包括：(a)使聚酯与根据本专利技术的酯酶或根据本专利技术的宿主细胞或根据本专利技术的组合物接触；和任选地(b)回收单体和/或低聚物。特别地，本专利技术提供降解PET的方法，其包括使PET与至少一种本专利技术的酯酶接触，和任选地回收PET的单体和/或低聚物。本专利技术还涉及降解含聚酯材料的至少一种聚酯的方法，其包括以下步骤：(a)使含聚酯材料与根据本专利技术的酯酶或宿主细胞接触，从而降解含聚酯材料的至少一种聚酯；和任选地(b)回收所述至少一种聚酯的单体和/或低聚物。本专利技术还涉及本专利技术的酯酶在降解PET或含PET的塑料制品中的用途。本专利技术还涉及含聚酯材料，其中包括本专利技术的酯酶或宿主细胞或组合物。本专利技术还涉及包含根据本专利技术的酯酶或宿主细胞的洗涤剂组合物或包含本专利技术的酯酶的组合物。专利技术详述定义通过参考以下定义将最好地理解本公开。本文中，术语“肽”、“多肽”、“蛋白质”、“酶”是指通过肽键连接的氨基酸链，而不管形成所述链的氨基酸的数量。本文中，氨基酸根据以下命名法由它们的单字母或三字母代码表示：A：丙氨酸(Ala)；C：半胱氨酸(Cys)；D：天冬氨酸(Asp)；E：谷氨酸(Glu)；F：苯丙氨酸(Phe)；G：甘氨酸(Gly)；H：组氨酸(His)；I：异亮氨酸(Ile)；K：赖氨酸(Lys)；L：亮氨酸(Leu)；M：甲硫氨酸(Met)；N：天冬酰胺(Asn)；P：脯氨酸(Pro)；Q：谷氨酰胺(Gln)；R：精氨酸(Arg)；S：丝氨酸(Ser)；T：苏氨酸(Thr)；V：缬氨酸(Val)；W：色氨酸(Trp)和Y：酪氨酸(Tyr)。术语“酯酶”是指根据酶命名法属于分类为EC3.1.1的一类水解酶的酶，其催化酯水解成酸和醇。术语“角质酶”或“角质水解酶”是指根据酶命名法分类为EC3.1.1.74的酯酶，其能够催化由角质和水生产角质单体的化学反应。术语“野生型蛋白质”或“亲本蛋白质”是指天然存在的多肽的非突变形式。在本案中，亲本酯酶是指具有SEQIDN°1所示的氨基酸序列的酯酶。术语“突变体”和“变体”是指衍生自SEQIDN°1且在一个或多个(例如，几个)位置处包含至少一种修饰或改变，即取代、插入和/或缺失并具有聚酯降解活性的多肽。可以通过本领域熟知的各种技术获得变体。特别地，用于改变编码野生型蛋白质的DNA序列的技术的实例包括但不限于定点诱变、随机诱变和合成寡核苷酸构建。因此，本文所用的与特定位置有关的术语“修饰”和“改变”是指与野生型蛋白质中该特定位置处的氨基酸相比，该特定位置处的氨基酸已被修饰。“取代”是指一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基取代。优选地，术语“取代”是指由另一个氨基酸残基替换一个氨基酸残基，所述另一个氨基酸残基选自天然存在的20个标准氨基酸残基、天然存在的稀有氨基酸残基(例如羟脯氨酸、羟赖氨酸、别羟基赖氨酸、6-N-甲基赖氨酸、N-乙基甘氨酸、N-甲基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、别异亮氨酸、N-甲基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.酯酶，其(i)与SEQ ID N°1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，(ii)与氨基酸序列SEQ ID N°1相比，在选自F208、D203、S248、V170、V177、T176、T61、S65或Y92的位置处包含至少四个取代，和(iii)与SEQ IDN°1的酯酶相比，显示出增加的聚酯降解活性和/或增加的热稳定性。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180727 EP 18306020.1;20181105 EP 18306447.61.酯酶，其(i)与SEQIDN°1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，(ii)与氨基酸序列SEQIDN°1相比，在选自F208、D203、S248、V170、V177、T176、T61、S65或Y92的位置处包含至少四个取代，和(iii)与SEQIDN°1的酯酶相比，显示出增加的聚酯降解活性和/或增加的热稳定性。


2.根据权利要求1所述的酯酶，其中所述酯酶至少包含位置F208+D203+S248处的取代和选自V170、V177、T176、T61、S65、N211或Y92的位置处的一个取代的组合。


3.根据权利要求1或2所述的酯酶，其中所述酯酶至少包含选自F208I+D203C+S248C或F208W+D203C+S248C的取代和选自V170I、V177I、T176N、T61M、S65T、N211D/M或Y92G/P/F的一个取代的组合。


4.根据权利要求1-3所述的酯酶，其中所述酯酶至少包含位置F208+D203+S248处的取代和选自V170或Y92的一个或两个取代的组合。


5.根据前述权利要求任一项所述的酯酶，其中所述酯酶至少包含选自以下的取代的组合：F208I+D203C+S248C+V170I、F208I+D203C+S248C+Y92G、F208I+D203C+S248C+V170I+Y92G、F208W+D203C+S248C+V170I、F208W+D203C+S248C+Y92G或F208W+D203C+S248C+V170I+Y92G。


6.根据前述权利要求任一项所述的酯酶，其中所述酯酶进一步包含至少一个选自S130、D175或H207的氨基酸残基。


7.根据前述权利要求任一项所述的酯酶，其中所述酯酶进一步包含对应于选自以下的残基的位置处的至少一个取代：T11、R12、A14、W69、R73、A205、N214、A215、A216、I217、F238、V242、D244、P245、A246、L247、D94、R138、D158、Q182、F187、P10、L15、D18、N87、S88、S95、Q99、K159、A174、A125、S218、S13、T16、L202、N204、S212、V219、Y220、Q237、L239、N241、N243、A62、L67、D91、P93、M131、P210、A209、P179、R30、G37、R72、S98、A68、R96、H156、H183、A17、T27、S48、F90、L82、G135、A140、N143、S145、A149、S164、V167、S206、N213、T252、E173、G53、A121、T157、N211、Y60、D63或S66。


8.根据前述权利要求任一项所述的酯酶，其中所述酯酶进一步包含选自以下的至少一个取代：A121S、N213P、S212F/T/I/L、A125G、N204D/I/L/Y/H/F、G135A、W69R、N214D/I/L/F/Y/H、N241P、N243P、R12F/Y/H、P179E、V242Y、V167Q或N211D/M。


9.根据前述权利要求任一项所述的酯酶，其中所述酯酶包含选自表1、表2和表3任一项所列的取代的组合的取代的组合。


10.根据前述权利要求任一项所述的酯酶，其中所述酯酶具有SEQIDN°2所...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·迪奎斯内，V·图尼尔，A·马蒂，
申请(专利权)人：卡比奥斯公司，
类型：发明
国别省市：法国;FR