青钱柳基因CpSE编码序列的克隆及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种青钱柳基因

【技术实现步骤摘要】
青钱柳基因CpSE编码序列的克隆及其应用
本专利技术涉及一种青钱柳基因CpSE编码序列的克隆及其应用，属于植物分子生物学和基因克隆

技术介绍
青钱柳是我国特有的集药用、材用、观赏、保健价值于一体的多功能树种，因其具有多种药理活性而受到大众青睐。三萜化合物作为青钱柳中重要的具有生物活性的化学成分，其含量高低是评定青钱柳产品质量的重要指标。选育优良资源获得三萜类化类物是青钱柳叶用人工林定向培育的主要目标，而三萜类化合物代谢途径中关键基因的时空表达特性是影响其产物积累的重要因素。对三萜类化合物代谢途径研究表明，SE基因是萜类合成途径下游众多分支中，通向三萜合成通路上且最靠近目标产物的关键酶基因，该基因的表达对于植物总三萜含量具有最直接的影响。此前，三萜含量测定的结果是仅有的筛选高三萜含量优良单株的方法，该方法具有取材样大，操作复杂且实验周期长等不足。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种青钱柳基因CpSE编码序列的克隆，根据其编码序列设计定量引物探针，监测关键酶基因的表达，只需几片叶子作为检测对象，实验当天即可获得检测结果，该方法可以更高效的实现青钱柳优良单株的选育。为解决上述技术问题，本专利技术提供一种青钱柳基因CpSE，所述CpSE的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术还提供青钱柳基因CpSE编码序列的克隆引物，所述引物的核苷酸序列如SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示。本专利技术还提供青钱柳基因CpSE编码序列的克隆方法，包括：提取青钱柳总RNA，反转录成cDNA；以cDNA为模板，利用上述的引物，通过PCR扩增获得该基因完整编码区序列；回收并纯化上述扩增产物中的目的片段，连接转化后进行测序，得到青钱柳基因CpSE的编码序列。本专利技术还提供依据上述的青钱柳基因CpSE编码序列设计荧光定量引物，并应用于筛选青钱柳高三萜含量优良单株中。所述引物的核苷酸序列如SEQIDNO：4和SEQIDNO：5所示。所述qRT-PCR反应体系为：SYBRGreen预混样10μL，10μmol/L的上下游引物各0.8μL，cDNA2μL，去离子水6.4μL，总体积20μL。所述qRT-PCR反应程序为：95℃，40s；变性95℃，15s；退火55℃，30s；延伸72℃，35s，其中变性、退火、延伸设置40个循环。本专利技术还提供上述的青钱柳基因CpSE探针引物应用于青钱柳单株中CpSE基因表达的季节动态变化中的应用。本专利技术所达到的有益效果：(1)本专利技术在获得青钱柳基因CpSE完整编码区序列之后，设计该基因荧光定量引物并验证其引物具有特异性。通过对青钱柳叶片中总三萜含量以及基因表达水平之间的相关性分析，结果表明CpSE基因的表达与三萜积累显著正相关(P<0.05)。(2)本专利技术将该基因荧光定量引物作为检测探针，对初选青钱柳优良单株(根据三萜含量分为高含量组H、中含量组M和低含量组L)分别进行荧光定量检测。结果发现，在9月时，叶片中CpSE的定量结果能够成功将高含量组与其他组别分开，该探针可用于筛选青钱柳高三萜含量的优良单株。(3)本专利技术获得了青钱柳基因CpSE编码序列的克隆，根据其编码序列设计定量引物探针，监测关键酶基因的表达，只需几片叶子作为检测对象，实验当天即可获得检测结果，该方法可以更高效的实现青钱柳优良单株的选育，并且可以进一步探究青钱柳单株中CpSE基因表达的季节动态变化。附图说明图1为目的青钱柳基因CpSE编码区序列的克隆，其中泳道M为DL2000Marker；1-4泳道为青钱柳基因CpSE编码区序列克隆；图2为目的青钱柳基因CpSE荧光定量PCR序列，其中泳道M为DL2000Marker；1-4泳道均为青钱柳基因CpSE荧光定量PCR序列；图3为青钱柳基因CpSE荧光定量PCR引物特异性检验结果，唯一波峰显示引物特异性良好；图4为16株初选青钱柳优株叶中总三萜含量不同组别间的季节动态变化，其中H、M、L分别表示总三萜含量高、中、低三个组别。不同大写字母表示相同月份不同组别之间差异显著(P<0.05)，不同小写字母表示同一组别不同月份之间差异显著(P<0.05)，下同。图5为16株初选青钱柳优株叶中CpSE基因表达量季节动态变化。图6为16株初选青钱柳优株叶中总三萜含量与CpSE基因相对表达量的相关性分析结果，结果表明，二者呈现正相关关系(R2＝0.0326)具体实施方式下面结合附图对本专利技术作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本专利技术的技术方案，而不能以此来限制本专利技术的保护范围。本专利技术提供的青钱柳CpSE编码序列的克隆及其应用，包括以下实施例。下列实施例中所用的材料和试剂如下：材料：青钱柳初选16株优良单株、PCR产物克隆载体pMD18-TVector(Takara)、大肠杆菌DH5α(全式金)。试剂：Omega植物RNA提取试剂盒；DNA回收试剂盒(Axygen)，2*TaqPCR预混样(天根)；Takara的反转录试剂盒、DTT(0.1mol/L)、MgCl2(25mmol/L)、dNTP(10mmol/L)、TaqDNA聚合酶、dNTP(10mM)、MarkerDL2000和无RNase的去离子水；试验中所用的引物由南京擎科生物公司合成。实施例1青钱柳基因CpSE编码序列的克隆，所述青钱柳CpSE编码序列的克隆是按照以下方法获得的：1、青钱柳总RNA的提取方法参照Omega公司提供的植物RNA提取试剂盒使用说明书，具体步骤如下：(1)取500μlRCL缓冲液于2mL离心管中(RNase-free)，加入10μLβ-巯基乙醇；(2)取新鲜组织样品(或-80℃冰箱储存的样品)约100mg液氮研磨，将磨成的粉末加入(1)中离心管中，震荡混匀；(3)55℃水浴2min后，冷却至室温，离心机最大转速5min；(4)上清转入含2mL收集管的gDNA过滤柱中，室温14000rpm，2min；(5)加入等体积RCB缓冲液(约450μL)于上一步收集管中，上下颠倒5-10次，与上步所得滤液混匀；(6)将混合液加入含有含2mL收集管的HiBindTMRNA小柱中，室温10000rpm，1min，若混合液一次放不下，可做两次；(7)弃滤液，加入400μlRWC洗脱液，室温1000rpm，1min。除去流动相与收集管，将柱子置于新的收集管上；(8)加入500μlRNA洗脱液II，室温10000rpm，1min，弃流动相；(9)重复(8)，弃流动相，空管室温最大转速离心2min；(10)将柱子置于新的1.5mL离心管(RNase-free)中，在柱子中央加入65℃预热过的无RNase的去离子水30-50μL，静置2min，室温10000rpm，1min，所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.青钱柳基因

【技术特征摘要】
1.青钱柳基因CpSE，其特征在于，所述CpSE的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。


2.青钱柳基因CpSE编码序列的克隆引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示。


3.青钱柳基因CpSE编码序列的克隆方法，其特征在于，包括：
提取青钱柳总RNA，反转录成cDNA；
以cDNA为模板，利用权利要求2所述的引物，通过PCR扩增获得该基因完整编码区序列；
回收并纯化上述扩增产物中的目的片段，连接转化后进行测序，得到青钱柳基因CpSE的编码序列。


4.根据权利要求3所述的青钱柳基因CpSE编码序列的克隆在筛选高三萜含量优良单株中的应用。


5.根据权利要求3所述的青钱柳基因C...

【专利技术属性】
技术研发人员：洑香香，陈小琳，陈必琴，方升佐，尚旭岚，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32