经修饰的冠状病毒结构蛋白制造技术

提供了经修饰的冠状病毒刺突(S)蛋白、包含所述经修饰的S蛋白的病毒样颗粒(VLP)和编码所述经修饰的S蛋白的核酸。还描述了用于经修饰的S蛋白和VLP在宿主或宿主细胞中的生产的方法。经修饰的S蛋白可以包含跨膜结构域(TM)或TM的一部分和胞质尾(CT)或CT的一部分，其中CT或CT的一部分来源于流感血球凝集素(HA)蛋白，并且其中TM或TM的一部分对于CT或CT的一部分是异源的。此外，描述了在受试者中诱导对冠状病毒感染的免疫性的方法，其包括向受试者施用包含经修饰的冠状病毒(S)蛋白或VLP的组合物。的组合物。的组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】经修饰的冠状病毒结构蛋白


[0001]本专利技术公开涉及经修饰的病毒结构蛋白。本专利技术还涉及包括经修饰的病毒结构蛋白的病毒样颗粒(VLP)以及在宿主或宿主细胞中生产VLP的方法。

技术介绍

[0002]冠状病毒(CoV)是属于尼多病毒目(Nidovirales)的最大一组病毒，其包括冠状病毒科(Coronavirinae)、动脉炎病毒科(Arteriviridae)、洋病毒科(Mesoniviridae)和杆状套病毒科(Roniviridae)。冠状病毒亚科包括冠状病毒科的两个亚科的一个，另一个是环曲病毒亚科(Torovirinae)。冠状病毒亚科进一步细分为四个属，即α
‑
冠状病毒、β
‑
冠状病毒、γ
‑
冠状病毒和δ
‑
冠状病毒。α
‑
冠状病毒和β
‑
冠状病毒的成员仅在哺乳动物中发现。α
‑
冠状病毒属包括两种人病毒，HCoV
‑
229E和HCoV
‑
NL63。重要的动物α
‑
冠状病毒为猪传染性胃肠炎病毒和猫传染性腹膜炎病毒。
[0003]严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS
‑
CoV
‑
2，也称为2019
‑
nCoV和HCoV
‑
19)是一种新谱系B型β
‑
冠状病毒(Beta
‑
CoV)并在2019年导致冠状病毒疾病(COVID
‑
19)，它是一种具有高死亡率和发病率的呼吸系统疾病，对全世界公共卫生造成重大影响。由于病毒的潜伏期和传播性，SARS
‑
CoV
‑
2的爆发(如2020年开始的大流行)是医疗保健系统面临的重大挑战。因此，迫切需要针对COVID
‑
19的治疗，但对SARS
‑
CoV
‑
2爆发的长期管理将需要有效的疫苗。
[0004]如最近的冷冻电子断层扫描和冷冻电子显微镜研究所示，冠状病毒的病毒颗粒是球形的，其直径为约118
‑
140nm。
[0005]冠状病毒最突出的结构特征是从病毒颗粒的表面发出的棒状刺突突起。冠状病毒颗粒由螺旋状核衣壳结构组成，由核衣壳(N)磷蛋白和病毒基因组RNA之间的结合形成，被脂质双分子层包围，其中插入三或四种类型的结构蛋白：刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)和包膜蛋白(E)，以及仅对于某些冠状病毒，血球凝集素
‑
酯酶(HE)蛋白(Masters PS.The molecular biology of coronaviruses.Adv Virus Res.2006；66:193
–
292)。
[0006]膜蛋白(M)是病毒颗粒中最丰富的结构蛋白。它是一种具有三个跨膜结构域的小(～25
‑
30kDa)蛋白，且据认为赋予病毒颗粒形状。包膜蛋白(E)是一种短的，由76
‑
109个氨基酸组成的完整膜蛋白，大小在从8.4kDa至12kDa的范围内。一级和二级结构显示E具有由7
‑
12个氨基酸组成的短亲水性氨基末端，接着是由25个氨基酸组成的大疏水性跨膜结构域(TMD)，和具有长亲水性羧基末端的末端，其包括大部分的蛋白。E蛋白参与病毒生命周期的一些方面，如组装、出芽、包膜形成和发病机制。
[0007]刺突(S)蛋白是一种糖蛋白，它是识别多种冠状病毒的宿主受体以及病毒和宿主细胞膜融合以供病毒进入细胞所必需的(Belouzard等人,Viruses 2012Jun；4(6):1011
‑
33)。作为病毒包膜的表面上的主要糖蛋白，冠状病毒科的S蛋白是由天然感染(包括SARS
‑
CoV
‑
2感染)引发的中和抗体的主要靶标，并且是靶向实验性疫苗候选的关键抗原。
[0008]SARS
‑
CoV
‑
2S蛋白(与其它冠状病毒的S蛋白一样)最初是作为前体蛋白合成的。单
Virology(2008)82:11318
–
11330，Huang等人.Journal of Virology(2004)78:12557
–
12565)。在哺乳动物细胞中，膜蛋白(M)和小包膜蛋白(E)的表达对于SARS
‑
CoV
‑
2VLP的有效形成和释放是必需的(Xu等人.Front.Bioeng.Biotechnol.,2020年7月30日)。尽管如此，组装SARS
‑
CoV VLP的最低要求仍然存在争议。Y.Huang等人.(Journal of Virology(2004)78:12557
–
12565)描述了在感染的人细胞中VLP的形成仅需要M和N病毒蛋白的共表达，而Siu等人.(Journal of Virology(2008)82:11318
–
11330)显示E和N蛋白两者都必须与M蛋白共表达才能在感染的哺乳动物细胞中有效产生和释放SARS
‑
CoV VLP。
[0021]WO2012/083445公开了在植物中SARS CoV S蛋白的产生，其中S蛋白的跨膜结构域和胞质尾结构域(TM/CT)被流感HA蛋白的TM/CT替换。
[0022]一些研究组提出用SARS
‑
CoV VLP免疫作为有效疫苗策略。在这些研究中使用了昆虫细胞中产生的VLP或哺乳动物细胞中产生的嵌合MHV/SARS
‑
CoV VLP(Lokugamage等人Vaccine 2008年2月6日；26(6):797
‑
808，Lu等人.2007Immunology 122496
‑
5024)。
[0023]然而，SARS
‑
CoV
‑
2VLP在其数量可满足全球人口广泛接种疫苗的需要的情况下的有效放大和生产需要有效的病毒结构蛋白和VLP生产。

技术实现思路

[0024]本专利技术涉及经修饰的病毒结构蛋白。本专利技术还涉及包括经修饰的病毒结构蛋白的病毒样颗粒(VLP)以及在宿主或宿主细胞中生产VLP的方法。更具体地，本专利技术涉及经修饰的冠状病毒S蛋白。本专利技术还涉及包括经修饰的S蛋白的病毒样颗粒(VLP)以及在宿主或宿主细胞中生产VLP的方法。
[0025]在一个方面，提供了经修饰的冠状病毒S蛋白，其依次包括：
[0026]来源于冠状病毒S蛋白的胞外结构域；
[0027]跨膜和胞质尾结构域(TMCT)，其中所述TMCT是嵌合TMCT，其包括：
[0028]跨膜结构域(TM)，其中所述TM或所述TM的一部分来源于冠状病毒S蛋白，和
[0029]胞质尾(本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种经修饰的冠状病毒S蛋白，其依次包括：来源于冠状病毒S蛋白的胞外结构域；跨膜和胞质尾结构域(TMCT)，其中所述TMCT是嵌合TMCT，其包括：跨膜结构域(TM)，其中所述TM或所述TM的一部分来源于冠状病毒S蛋白，和胞质尾(CT)，其中所述CT或所述CT的一部分来源于流感血球凝集素(HA)蛋白。2.根据权利要求1所述的经修饰的冠状病毒S蛋白，其中所述TM直接融合至所述CT。3.根据权利要求1所述的经修饰的冠状病毒S蛋白，其中所述TM是包括来源于所述冠状病毒S蛋白TM的N末端序列和来源于所述流感HA蛋白TM的C末端序列的嵌合TM。4.根据权利要求3所述的经修饰的冠状病毒S蛋白，其中所述嵌合TM包括来源于所述冠状病毒S蛋白TM的N末端序列，所述N末端序列包括对应于SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：169的氨基酸1
‑
20的至少20个氨基酸，或对应于SEQ ID NO：118或SEQ ID NO：164的氨基酸1
‑
21的至少21个氨基酸，或对应于SEQ ID NO：123的氨基酸1
‑
22的至少22个氨基酸，和来自所述流感HA蛋白TM的C末端的一个或多于一个氨基酸。5.根据权利要求4所述的经修饰的冠状病毒S蛋白，其中来源于所述流感HA蛋白TM的C末端的一个或多于一个氨基酸选自AGL或AGL的保守替换、MAGL或MAGL的保守替换。6.根据权利要求1所述的经修饰的冠状病毒S蛋白，其中所述CT是包括来源于所述冠状病毒S蛋白CT的N末端序列和来源于所述流感HA蛋白CT的C末端序列的嵌合CT。7.根据权利要求6所述的经修饰的冠状病毒S蛋白，其中所述嵌合CT包括来源于所述流感HA蛋白CT的C末端序列，所述C末端序列包括对应于SEQ ID NO：18、126、128、129、130或131的氨基酸27
‑
37的氨基酸，或对应于SEQ ID NO：127的氨基酸27
‑
36的氨基酸，和来自所述冠状病毒S蛋白CT的所述N末端的一个或多于一个氨基酸。8.根据权利要求7所述的经修饰的冠状病毒S蛋白，其中来自所述冠状病毒S蛋白CT的所述N末端的所述一个或多于一个氨基酸选自C或C的保守替换、CC或CC的保守替换、或者CCM或CCM的保守替换。9.根据权利要求3所述的经修饰的冠状病毒S蛋白，其中所述嵌合TM包括对应于SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：169的氨基酸1
‑
20的氨基酸，或对应于SEQ ID NO：118或SEQ ID NO：164的氨基酸1
‑
21的氨基酸，或对应于SEQ ID NO：123的氨基酸1
‑
22的氨基酸。10.根据权利要求4所述的经修饰的冠状病毒S蛋白，其中所述嵌合CT包括对应于SEQ ID NO：18、126、128、129、130或131的氨基酸27
‑
37的氨基酸，或SEQ ID NO：127的氨基酸27
‑
36。11.根据权利要求1所述的经修饰的冠状病毒S蛋白，其中所述嵌合TMCT包括嵌合TM及嵌合CT，所述嵌合TM包括对应于SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：169的氨基酸1
‑
20的氨基酸，或对应于SEQ ID NO：118或SEQ ID NO：164的氨基酸1
‑
21的氨基酸，或对应于SEQ ID NO：123的氨基酸1
‑
22的氨基酸，所述嵌合CT包括对应于SEQ ID NO：18、126、128、129、130或131的氨基酸27
‑
37的氨基酸，对应于SEQ ID NO：127的氨基酸27
‑
36的氨基酸或其组合。12.根据权利要求1
‑
11中任一项所述的经修饰的S蛋白，其中与野生型冠状病毒S蛋白氨基酸序列相比时，所述S蛋白包括一个或多于一个氨基酸替换。13.根据权利要求12所述的经修饰的S蛋白，其中所述一个或多于一个氨基酸替换包括：
i)限制在S1亚基与S2亚基之间的切割位点处的加工的替换；ii)一个或多于一个氨基酸替换为一个或多于一个的脯胺酸；或iii)限制在所述S1亚基与所述S2亚基之间的切割位点处的加工的替换以及一个或多于一个氨基酸替换为一个或多于一个脯胺酸。14.根据权利要求12或13所述的经修饰的S蛋白，其中与SEQ ID NO：2的参考氨基酸序列相比时，所述一个或多于一个氨基酸替换对应于在位置971和972处的氨基酸。15.根据权利要求12或13所述的经修饰的S蛋白，其中与SEQ ID NO：2的参考氨基酸序列相比时，所述一个或多于一个氨基酸替换对应于在位置802、927、971和972处的氨基酸。16.根据权利要求14或15所述的经修饰的S蛋白，其中与SEQ ID NO：2的参考氨基酸序列相比时，所述经修饰的S蛋白还包括对应于在位置667、668、670处或其组合的氨基酸的一个或多于一个氨基酸替换。17.根据权利要求16所述的经修饰的S蛋白，其中对应于在SEQ ID NO：2的位置667处的氨基酸的氨基酸替换是甘氨酸或甘氨酸的保守替换，对应于SEQ ID NO：2的位置668的氨基酸替换是丝氨酸或丝氨酸的保守替换，对应于SEQ ID NO：2的位置670的氨基酸替换是丝氨酸或丝氨酸的保守替换，对应于SEQ ID NO：2的位置971和972处的氨基酸氨基酸替换是脯氨酸或脯氨酸的保守替换。18.根据权利要求16所述的经修饰的S蛋白，其中对应于在SEQ ID NO：2的位置667处的氨基酸的氨基酸替换是甘氨酸或甘氨酸的保守替换，对应于SEQ ID NO：2的位置668的氨基酸替换是丝氨酸或丝氨酸的保守替换，对应于SEQ ID NO：2的位置670的氨基酸替换是丝氨酸或丝氨酸的保守替换，对应于SEQ ID NO：2的位置802、927、971和972处的氨基酸的氨基酸替换是脯氨酸或脯氨酸的保守替换。19.根据权利要求14
‑
18中任一项所述的经修饰的S蛋白，其中与SEQ ID NO：2的参考氨基酸序列相比时，经修饰的S蛋白还包括对应于位置923处的氨基酸的氨基酸替换。20.根据权利要求19所述的经修饰的S蛋白，其中对应于SEQ ID NO：2的位置667处的氨基酸的氨基酸替换是甘氨酸或甘氨酸的保守替换，对应于SEQ ID NO：2的位置668处的氨基酸替换是丝氨酸或丝氨酸的保守替换，对应于SEQ ID NO：2的位置670的氨基酸替换是丝氨酸或丝氨酸的保守替换，对应于SEQ ID NO：2的位置802、927、971和972处的氨基酸的氨基酸替换是脯氨酸或脯氨酸的保守替换，并且对应于SEQ ID NO：2的位置923的氨基酸替换是苯丙氨酸或苯丙氨酸的保守替换。21.根据权利要求12
‑
20中任一项所述的经修饰的S蛋白，其中当与在宿主或宿主细胞中表达的不具有所述一个或多于一个替换的相应S蛋白的得率相比时，在所述宿主或宿主细胞中表达时，所述一个或多于一个替换将所述S蛋白维持在融合前状态或产生更高得率的所述经修饰的S蛋白。22.根据权利要求1
‑
21中任一项所述的经修饰的S蛋白，其中所述S蛋白包括S1亚基和S2亚基，其中所述S2亚基包括所述嵌合TMCT。23.根据权利要求1
‑
22中任一项所述的经修饰的S蛋白，其中所述流感HA蛋白来源于乙型流感或H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16亚型流感。24.根据权利要求1
‑
23中任一项所述的经修饰的S蛋白，其中所述冠状病毒S蛋白来源于SARS
‑
CoV
‑
2、SARS
‑
CoV
‑
1、MERS
‑
CoV、OC43
‑
CoV或229E
‑
CoV。
25.根据权利要求1
‑
23中任一项所述的经修饰的S蛋白，其中所述胞外结构域来源于SARS
‑
CoV
‑
2、SARS
‑
CoV
‑
1、MERS
‑
CoV、OC43
‑
CoV或229E
‑
CoV，所述TM或所述TM的一部分来源于SARS
‑
CoV
‑
2、SARS
‑
CoV
‑
1、MERS
‑
CoV、OC43
‑
CoV或229E
‑
CoV，或其中所述胞外结构域和所述TM或所述TM的一部分来源于SARS
‑
CoV
‑
2、SARS
‑
CoV
‑
1、MERS
‑
CoV、OC43
‑
CoV或229E
‑
CoV。26.根据权利要求1
‑
25中任一项所述的经修饰的S蛋白，其中所述TMCT包括与下列序列具有约80％至约100％的同一性的序列：SEQ ID NO：18、19、37、38、39、64、126、127、128、129、130、131、118、119、120、123、124、125、134、135、164、165、166、169、170、171、172或173。27.根据权利要求1
‑
26中任一项所述的经修饰的S蛋白，其中所述经修饰的S蛋白作为前体蛋白产生，所述前体蛋白包括所述经修饰的S蛋白和信号肽。28.根据权利要求27所述的经修饰的S蛋白，其中所述信号肽对于所述经修饰的S蛋白是天然或非天然的。29.根据权利要求27或28所述的经修饰的S蛋白，其中所述信号肽来源于蛋白二硫键异构酶(PDI)的信号肽。30.根据权利要求1
‑
29中任一项所述的经修饰的S蛋白，其中所述经修饰的S蛋白包括植物特异性N聚糖。31.根据权利要求1所述的经修饰的S蛋白，其中所述S蛋白的氨基酸序列与以下各项具有80％至100％的同一性：SEQ ID NO：5、21、30、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、95、96、97、108、109、110、144、145、146、155、156或157的氨基酸，或SEQ ID NO：47的氨基酸24
‑
1259，SEQ ID NO：48的氨基酸25
‑
1259，SEQ ID NO：49的氨基酸25
‑
1259，SEQ ID NO：50的氨基酸25
‑
1259，SEQ ID NO：51的氨基酸25
‑
1259，SEQ ID NO：52的氨基酸25
‑
1259，SEQ ID NO：53的氨基酸25
‑
1259，SEQ ID NO：54的氨基酸25
‑
1259，SEQ ID NO：55的氨基酸25
‑
1259，SEQ ID NO：56的氨基酸25
‑
1259，SEQ ID NO：57的氨基酸25
‑
1259，SEQ ID NO：58的氨基酸25
‑
1259，SEQ ID NO：59的氨基酸25
‑
1262，SEQ ID NO：60的氨基酸25
‑
1261，SEQ ID NO：61的氨基酸25
‑
1...

【专利技术属性】
技术研发人员：PO，
申请(专利权)人：麦迪卡格公司，
类型：发明
国别省市：