植物中类轮状病毒颗粒的产生制造技术

本申请涉及植物中类轮状病毒颗粒的产生。本发明专利技术提供了在植物中产生类病毒颗粒(VLP)的方法。所述方法包括将第一核酸引入至所述植物或所述植物的部分中。所述第一核酸包含在所述植物中具有活性并且操作性地连接至编码一个或更多个轮状病毒结构性蛋白质(例如但不限于轮状病毒蛋白质VP2)的核苷酸序列的第一调控区。所述核苷酸序列还可以包含一个或一个以上的扩增元件和/或区室靶向序列。可以将第二核酸引入至所述植物或所述植物的部分中。所述第二核酸包含在所述植物中具有活性并且操作性地连接至编码一个或更多个轮状病毒结构性蛋白质(例如但不限于轮状病毒蛋白质VP6)的核苷酸序列的第二调控区。

【技术实现步骤摘要】
植物中类轮状病毒颗粒的产生本申请是申请日为2013年5月10日、专利技术名称为“植物中类轮状病毒颗粒的产生”的中国专利技术专利申请No.201380024759.7(PCT申请号为PCT/CA2013/050364)的分案申请。
本专利技术涉及在植物中产生轮状病毒结构性蛋白质。更具体地，本专利技术涉及在植物中产生包含轮状病毒结构性蛋白质的类病毒颗粒。
技术介绍
轮状病毒感染为全球性的问题，主要影响五岁以下的儿童。它导致严重的肠胃炎，并且在最坏的情况下导致死亡。轮状病毒是呼肠孤病毒科(Reoviridae)病毒(轮状病毒属)的成员，其感染肠胃系统与呼吸道。该名称源于当通过负相差电子显微镜(negativecontrastelectronmicroscopy)观察时病毒粒子的轮状外观(图1a；现有技术)。轮状病毒通常为球形，并且因外壳和内壳或它们的双壳衣壳结构而得名。分别地，外衣壳直径为约70nm，内衣壳直径为约55nm。轮状病毒的双壳衣壳围绕包括内蛋白质壳和基因组的核心。轮状病毒的基因组由编码至少11个轮状病毒蛋白的双链RNA片断组成。dsRNA编码六个结构性蛋白质(VP)与六个非结构性蛋白质(NSP)(图1c；现有技术)。结构性蛋白质包含VP1、VP2、VP3、VP4、VP6与VP7(图1b；现有技术)。三个同心层分别通过VP2、VP6与VP7的组装形成，其中VP4在病毒结构表面上形成“刺突(spike)”。NSPs是在受感染的细胞内合成的，并且在复制周期的多个部分中起作用或者与宿主蛋白中的一些相互作用从而影响发病或对感染的免疫应答(GreenbergandEstes，2009)。VP2是102kDa的蛋白质，并且是病毒核心中含量最丰富的蛋白质。它形成最内层的结构性蛋白质层，并且为病毒核心的组分和转录酶的正确组装提供骨架(Lawton，2000)。VP1是125kDa的最大的病毒蛋白，其作为轮状病毒的RNA依赖性聚合酶发挥作用，产生核心复制中间产物，并且与VP2在其二十面体顶点处相结合(VaraniandAllain,2002；Vende等人，2002)。VP3(98kDa的蛋白质)也直接与病毒基因组相结合，从而起到将5’端帽结构添加至病毒mRNA的mRNA加帽酶(cappingenzyme)的作用。VP1与VP3一起形成附着至VP2衣壳层的外部5倍顶点的复合物(Angel，2007)。VP6是42kDa的蛋白质，其形成病毒核心的中层壳，它是主要衣壳蛋白，并且在病毒颗粒的总蛋白质物质中占超过50％(González等人，2004；Estes，1996)。它是基因转录所必需的，并且可以通过在核心中将VP1锚定至VP2而在轮状病毒RNA的封装中起作用，如在呼肠孤病毒科的另一成员蓝舌病毒(bluetouguevirus)中所观察到的那样。它还决定轮状病毒分为五组(A至E)的分类，其中A组最常感染人类(Palombo，1999)。轮状病毒A组中的VP6具有至少四个亚组(SG)：SGI、SGII、SG(I+II)与SG非-(I+II)，这取决于SG特异性表位的存在与否。B组与C组缺少A组共有的抗原，但也已知会感染人，而D组仅感染动物，例如，鸡与奶牛(Thongprachum，2010)。两种外部衣壳蛋白VP7，即37kDa的糖蛋白(G)与87kDa的蛋白酶敏感性VP4(P)定义了病毒的血清型。这两种蛋白质诱导中和抗体反应并因而被用于将轮状病毒血清型分类为双命名系统，这取决于G-P抗原组合(例如，G1P[8]或G2P[4])(Sanchez-Padilla等人，2009)。VP4蛋白二聚化从而在病毒外壳上形成60个刺突，所述刺突直接参与宿主细胞进入的初始阶段。刺突蛋白在氨基酸(aa)位置248处包含切割位点。一旦感染，它被蛋白酶胰蛋白酶切割，从而产生VP5(529aa，60kDa)和VP8(246aa，28kDa)(Denisova等人，1999)。该过程增强了病毒的感染性(宿主细胞的细胞附着与侵入)并且稳定了刺突结构(Glass，2006)。VP7糖蛋白形成病毒的第三层或外层。目前，27G与35P基因型是已知的(GreenbergandEstes，2009)。VP4与VP7是参与病毒中和的主要抗原并且是疫苗开发的重要靶标(Dennehy，2007)。在受感染的哺乳动物细胞中，轮状病毒经历独特形式的形态发生以形成完整的三层VP2/6/4/7病毒颗粒(Lopez等人，2005)。三层衣壳是非常稳定的复合物，使其能够粪-口传播并将病毒递送至小肠，在此其感染接近绒毛尖端的非分裂的分化肠上皮细胞(GreenbergandEstes，2009)。首先，完整的病毒通过病毒表面上的60个VP4二聚体刺突附着在独立于唾液酸的受体上(LundgrenandSvensson，2001)。病毒表面上的60个VP4二聚体刺突允许病毒附着至这些细胞受体。VP4对通过胰蛋白酶的蛋白水解切割敏感，这导致构象变化，所述变化暴露出用于和一系列共同受体相互作用的、糖蛋白表面上的额外附着位点。然而，多步附着和进入过程尚未被清楚了解，但病毒被递送穿过宿主细胞膜。VP7外部衣壳(也参与了进入过程)在该过程中被除去，并且双层颗粒(DLP)在囊泡中被递送至细胞质(图2；现有技术)。DLP从囊泡脱离并且进入非膜结合的细胞质内含物(cytoplasmicinclusions)中。通过VP1的基因组早期转录在颗粒中开始，从而使得dsRNA永不暴露于细胞质。RNA复制与核心形成在这些非膜结合的细胞质内含物中发生。然后，初期(+)RNA被运输进细胞质并用作病毒蛋白质合成的模板。VP4在胞质溶胶中产生并被运输至粗面内质网(RER)，并且VP7被分泌进RER。VP2与VP6在病毒体的胞液中产生并组装，并且随后出芽(bud)进RER区室，在该过程中获得瞬时膜包膜(Lopez等人，2005；Tian等人，1996)。在RER中，在轮状病毒糖蛋白NSP4的关键性参与下，病毒颗粒的瞬时膜包膜被移除并被VP4与VP7蛋白质单体代替(Tian等人，1996；Lopez等人，2005；Gonzalez等人，2000)。NSP4在ER膜中作为细胞内受体发挥作用，并且结合新产生的亚病毒颗粒，以及还可能结合刺突蛋白VP4(Tian等人，1996)。NSP4也对人有毒，并且是腹泻的致病物。随后，完整、成熟的颗粒通过高尔基体从RER中转移至质膜进行分泌(Lopez等人，2005)。已采用多种不同的手段来产生适合保护人群以抵挡多种血清型的轮状病毒的轮状病毒疫苗。这些手段包括多种Jennerian手段、使用减毒活病毒、使用类病毒颗粒、核酸疫苗和作为免疫原的病毒亚单元。目前市场上有两种可用的经口疫苗，然而，在一些发展中国家由于病毒株变化以及其它病原体的存在，这些疫苗效力较低。美国专利No.4,624,850、4,636,385、4,704,275、4,751,080、4,927,628、5,474,773与5,695,767每篇描述了多种轮状病毒疫苗和/或制备它们的方法。该组成员共有的共同性为这些疫苗中的每一种均依赖全病毒颗粒的使用以产生最终的轮状病毒疫苗。考虑到对有效的多价疫苗的长期需求，很明显该本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.在植物、植物的部分或植物细胞中产生类轮状病毒颗粒(RLP)的方法，所述方法包括：a)将下述第一核酸、下述第二核酸和下述第三核酸引入至该植物、植物的部分或植物细胞中，所述第一核酸包含在所述植物中具有活性并且操作性地连接至编码第一轮状病毒结构性蛋白质的第一核苷酸序列的第一调控区，所述第二核酸包含在所述植物中具有活性并且操作性地连接至编码第二轮状病毒结构性蛋白质的第二核苷酸序列的第二调控区，所述第三核酸包含在所述植物中具有活性并且操作性地连接至编码第三轮状病毒结构性蛋白质的第三核苷酸序列的第三调控区，b)在允许所述第一、第二和第三核酸瞬时表达的条件下培育所述植物、植物的部分或植物细胞，由此产生所述RLP。

【技术特征摘要】
2012.05.11 US 61/646,0581.在植物、植物的部分或植物细胞中产生类轮状病毒颗粒(RLP)的方法，所述方法包括：a)将下述第一核酸、下述第二核酸和下述第三核酸引入至该植物、植物的部分或植物细胞中，所述第一核酸包含在所述植物中具有活性并且操作性地连接至编码第一轮状病毒结构性蛋白质的第一核苷酸序列的第一调控区，所述第二核酸包含在所述植物中具有活性并且操作性地连接至编码第二轮状病毒结构性蛋白质的第二核苷酸序列的第二调控区，所述第三核酸包含在所述植物中具有活性并且操作性地连接至编码第三轮状病毒结构性蛋白质的第三核苷酸序列的第三调控区，b)在允许所述第一、第二和第三核酸瞬时表达的条件下培育所述植物、植物的部分或植物细胞，由此产生所述RLP。2.通过下述方法在植物、植物的部分或植物细胞中产生的类轮状病毒颗粒(RLP)，所述方法包括：a)将下述第一核酸、下述第二核酸和下述第三核酸引入至该植物、植物的部分或植物细胞中，所述第一核酸包含在所述植物中具有活性并且操作性地连接至编码第一轮状病毒结构性蛋白质的第一核苷酸序列的第一调控区，所述第二核酸包含在所述植物中具有活性并且操作性地连接至编码第二轮状病毒结构性蛋白质的第二核苷酸序列的第二调控区，所述第三核酸包含在所述植物中具有活性并且操作性地连接至编码第三轮状病毒结构性蛋白质的第三核苷酸序列的第三调控区，b)在允许所述第一、第二和第三核酸瞬时表达的条件下培育所述植物、植物的部分或植物细胞，由此产生所述RLP。3.权利要求2的RLP，其中，在步骤a)中将下述第四核酸引入至所述植物、植物的部分或植物细胞，所述第四核酸包含在所述植物中具有活性并且操作性地连接至编码第四轮状病毒结构性蛋白质的第四核苷酸序列的第四调控区，并且，当在步骤b)中培育所述植物、植物的部分或植物细胞时所述第四核酸被表达。4.权利要求2的RLP，其中所述第一轮状病毒结构性蛋白质是VP2，所述第二轮状病毒结构性蛋白质是VP6，所述第三轮状病毒结构性蛋白质是VP4，并且所述RLP是双层RLP。5.权利要求2的RLP，其中所述第一轮状病毒结构性蛋白质是VP2，所述第二轮状病毒结构性蛋白质是VP6，所述第三轮状病毒结构性蛋白质是VP7，并且所述RLP是三层RLP。6.一种组合物，包含有效剂量的权利要求2至...

【专利技术属性】
技术研发人员：MA·达奥斯特，N·兰德里，PO·拉沃伊，新井正明，浅原尚美，D·L·R·穆特法，I·I·希泽洛斯，E·P·里比基，
申请(专利权)人：麦迪卡格公司，田边三菱制药株式会社，
类型：发明
国别省市：加拿大,CA