一种重组单纯疱疹病毒及其用途制造技术

本发明专利技术涉及病毒学和肿瘤治疗领域。特别地，本发明专利技术提供了一种重组单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus，HSV)，其能够特异性地在肿瘤细胞中以高水平复制并杀伤肿瘤细胞，但是在正常细胞中以低水平复制，从而本发明专利技术的重组单纯疱疹病毒不仅对肿瘤细胞具有高杀伤力，而且具有显著降低的副作用(特别是神经毒性)。进一步，本发明专利技术涉及了基于所述重组单纯疱疹病毒构建的病毒载体，包含所述重组单纯疱疹病毒或所述病毒载体的药物组合物，以及所述重组单纯疱疹病毒或所述病毒载体的用途。本发明专利技术的重组单纯疱疹病毒可以用于感染并杀伤肿瘤细胞，并且可以用于将基因药物递送至肿瘤细胞内，进行基因治疗。

【技术实现步骤摘要】
一种重组单纯疱疹病毒及其用途
本专利技术涉及病毒学和肿瘤治疗领域。特别地，本专利技术提供了一种重组单纯疱疹病毒(HerpesSimplexVirus，HSV)，其能够特异性地在肿瘤细胞中以高水平复制并有效杀伤肿瘤细胞，但是在正常细胞中以低水平复制，从而本专利技术的重组单纯疱疹病毒不仅对肿瘤细胞具有高杀伤力，而且具有显著降低的副作用(特别是神经毒性)。进一步，本专利技术涉及了基于所述重组单纯疱疹病毒构建的病毒载体，包含所述重组单纯疱疹病毒或所述病毒载体的药物组合物，以及所述重组单纯疱疹病毒或所述病毒载体的用途。本专利技术的重组单纯疱疹病毒可以用于感染并杀伤肿瘤细胞，并且可以用于将基因药物递送至肿瘤细胞内，进行基因治疗。
技术介绍
放疗、化疗和靶向药物是目前广泛采用的肿瘤治疗方案，但是它们都存在着治疗不彻底、毒副作用大、容易产生抗药性、无法控制肿瘤复发和转移等诸多问题，肿瘤治疗效果不理想。因此，急需开发新型高效的肿瘤治疗方法。近年来，人们对肿瘤与免疫关系的认识大幅提高，肿瘤免疫治疗发展迅速，其中，使用溶瘤病毒(OncolyticVirus，OV)的疗法作为一种新型的肿瘤免疫治疗方法备受瞩目(LichtyBD,BreitbachCJ,StojdlDF,etal.Goingviralwithcancerimmunotherapy[J].NatRevCancer,2014,14(8):559-567)。溶瘤病毒是一类具有嗜肿瘤特性的病毒，其能够选择性地在肿瘤细胞中复制，而在正常细胞内的增殖则受到限制。溶瘤病毒能在肿瘤细胞中复制从而导致肿瘤细胞溶解和死亡，并且扩增的病毒能继续感染周围的肿瘤细胞，产生一种级联效应。此外，溶瘤病毒在裂解肿瘤细胞的过程中，还能够释放肿瘤抗原，刺激机体产生针对肿瘤抗体的特异性抗肿瘤免疫，进一步扩大溶瘤病毒的溶瘤效果。溶瘤病毒是目前恶性肿瘤治疗领域中最为热门的新型基因治疗药物。特别是在实体瘤的局部控制治疗上，溶瘤病毒的感染和增殖不仅会导致注射部位的肿瘤消融，而且肿瘤细胞的裂解会导致肿瘤抗原从肿瘤细胞中释放，从而诱导机体产生系统性的抗肿瘤免疫应答来对抗其它部位的肿瘤，这可能是机体系统性控制肿瘤扩散和转移的关键免疫应答(RussellSJ,PengKW,BellJC.Oncolyticvirotherapy[J].NatBiotechnol,2012,30(7):658-670)。目前的溶瘤病毒按病毒种类划分可分为十余种，其中，溶瘤型I型单纯疱疹病毒(HSV-1)因所使用的病毒载体具有基因容量大、复制周期短、感染效率高、可插入多个治疗基因等优势，成为国内外基因工程肿瘤治疗药物的首选。HSV-1病毒属于疱疹病毒科，是一类有包膜的DNA病毒，能引起人口唇、眼睛和面部皮肤的疱疹。据流行性研究统计，60％以上人群都感染过HSV-1病毒。HSV-1病毒的基因组由152kb的双股线性DNA组成，包含相互连接的两个片段：长片段和短片段(MacdonaldSJ,MostafaHH,MorrisonLA,etal.Genomesequenceofherpessimplexvirus1strainKOS[J].JVirol,2012,86(11):6371-6372)。长片段(L区)约占基因组的82％，而短片段(S区)则约占基因组的18％，并且长片段和短片段通过连接区连接在一起。L区包含一对倒置重复片段，其间的区段则称为独特区段UL；S区也具有一对倒置重复片段，其间的区段则称为独特区段Us。目前，HSV-1KOS株的全基因组测序工作已完成。KOS病毒株的基因组共含有152011个核苷酸碱基，并且一共包含72个编码蛋白的基因，其中独特区段UL包含56个基因，独特区段Us包含12个基因，并且，UL末端倒置重复区段(TRL)和UL中间倒置重复序列(IRL)上各含有3个相同的基因(分别为ICP34.5、ICP0和LAT)，US末端倒置重复区段(TRS)和US中间倒置重复序列(IRS)上各含有1个相同的基因(ICP4)。在HSV-1大量复制时，HSV-1在转录水平上以级联调控的方式合成蛋白质。这些蛋白质按其合成时序的先后，可分为α、β、γ三类。HSV-1病毒首先转录α类基因，这些基因编码5个立即早期蛋白(immediate-earlyprotein，IEprotein)，包括ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47，继而在转录水平上激活β类和γ类基因，促进病毒早期(E)和晚期(L)蛋白表达。立即早期蛋白ICP0能独立激活所有类别的病毒基因(IE,E和L)以及多种细胞基因(在某些情况下，可能需要ICP4的协同激活)。ICP0不仅能同细胞内的多种转录因子或调节蛋白相互作用，激活宿主细胞中某些基因的转录；而且能通过其泛素连接酶E3功能域，调控病毒基因组的表达以及病毒基因的转录(KawaguchiY,BruniR,RoizmanB.Interactionofherpessimplexvirus1alpharegulatoryproteinICP0withelongationfactor1delta:ICP0affectstranslationalmachinery[J].JVirol,1997,71(2):1019-1024)。ICP4和ICP27是病毒复制所必须的立即早期蛋白(DeLucaNA,McCarthyAM,SchafferPA.Isolationandcharacterizationofdeletionmutantsofherpessimplexvirustype1inthegeneencodingimmediate-earlyregulatoryproteinICP4[J].JVirol,1985,56(2):558-570；SacksWR,GreeneCC,AschmanDP,etal.Herpessimplexvirustype1ICP27isanessentialregulatoryprotein[J].JVirol,1985,55(3):796-805)。ICP27是一个多功能的调节蛋白，其通过与RNA聚合酶II相互作用来促进病毒基因的转录。ICP27能够与ICP4相互作用共同激活早期和晚期基因表达。ICP27还能够通过上调病毒复制相关基因，从而间接促进病毒DNA复制。此外，ICP27还具有抑制细胞原始RNA剪接，促进病毒mRNA的转运及翻译等功能。ICP34.5可逆转抗病毒蛋白PKR的作用，使宿主和病毒蛋白合成继续进行，从而有利于病毒复制。此外，ICP34.5还能通过调节PP1磷酸酶活性来逃避宿主的抗病毒反应(RandallG,RoizmanB.TranscriptionofthederepressedopenreadingframePofherpessimplexvirus1precludestheexpressionoftheantisensegamma(1)34.5geneandmayaccountfortheattenuationofthemutantvirus[J].JVirol,1997,71(10):7750-7757)。至今，世界上已经有多种溶瘤型HSV-1病毒载体处于临床前或临本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组HSV病毒，其不表达功能性ICP0蛋白和ICP34.5蛋白；但能够表达功能性UL43蛋白，功能性UL41蛋白(即，vhs蛋白)，功能性UL48蛋白(即，VMW65蛋白)，或其任何组合；优选地，所述重组HSV病毒为重组HSV‑1病毒，重组HSV‑2病毒，或HSV‑1/HSV‑2嵌合病毒；优选地，所述重组HSV病毒衍生自HSV‑1病毒株KOS。

【技术特征摘要】
2017.03.09 CN 2017101366381;2017.05.02 CN 201710301.一种重组HSV病毒，其不表达功能性ICP0蛋白和ICP34.5蛋白；但能够表达功能性UL43蛋白，功能性UL41蛋白(即，vhs蛋白)，功能性UL48蛋白(即，VMW65蛋白)，或其任何组合；优选地，所述重组HSV病毒为重组HSV-1病毒，重组HSV-2病毒，或HSV-1/HSV-2嵌合病毒；优选地，所述重组HSV病毒衍生自HSV-1病毒株KOS。2.权利要求1的重组HSV病毒，其中，所述重组HSV病毒的基因组包含下述修饰：2个拷贝的ICP0基因各自独立地包含功能丧失性突变(例如，一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)或者被缺失或者被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)；并且，2个拷贝的ICP34.5基因各自独立地包含功能丧失性突变(例如，一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)或者被缺失或者被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)；例如，在所述重组HSV病毒的基因组中，(a1)一个拷贝的ICP0基因包含功能丧失性突变(例如一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)，并且另一个拷贝的ICP0基因包含功能丧失性突变(例如，一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)或者被缺失或者被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)；或者(b1)一个拷贝的ICP0基因被缺失，并且另一个拷贝的ICP0基因包含功能丧失性突变(例如，一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)或者被缺失或者被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)；或者(c1)一个拷贝的ICP0基因被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)，并且另一个拷贝的ICP0基因包含功能丧失性突变(例如，一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)或者被缺失或者被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)；并且(a2)一个拷贝的ICP34.5基因包含功能丧失性突变(例如一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)，并且另一个拷贝的ICP34.5基因包含功能丧失性突变(例如，一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)或者被缺失或者被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)；或者(b2)一个拷贝的ICP34.5基因被缺失，并且另一个拷贝的ICP34.5基因包含功能丧失性突变(例如，一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)或者被缺失或者被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)；或者(c2)一个拷贝的ICP34.5基因被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)，并且另一个拷贝的ICP34.5基因包含功能丧失性突变(例如，一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)或者被缺失或者被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)；优选地，所述2个拷贝的ICP0基因包含相同的功能丧失性突变或者不同的功能丧失性突变；或者都被缺失；或者被置换为相同的外源核苷酸序列或者不同的外源核苷酸序列；优选地，所述2个拷贝的ICP34.5基因包含相同的功能丧失性突变或者不同的功能丧失性突变；或者都被缺失；或者被置换为相同的外源核苷酸序列或者不同的外源核苷酸序列；优选地，在所述重组HSV病毒的基因组中，(1)所述2个拷贝的ICP0基因各自独立地包含功能丧失性突变(例如一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)，并且，所述2个拷贝的ICP34.5基因各自独立地包含功能丧失性突变(例如一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)；或者(2)所述2个拷贝的ICP0基因各自独立地包含功能丧失性突变(例如一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)，并且，所述2个拷贝的ICP34.5基因被缺失；或者(3)所述2个拷贝的ICP0基因各自独立地包含功能丧失性突变(例如一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)，并且，所述2个拷贝的ICP34.5基因各自独立地被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)；或者(4)所述2个拷贝的ICP0基因被缺失；并且，所述2个拷贝的ICP34.5基因各自独立地包含功能丧失性突变(例如一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)；或者(5)所述2个拷贝的ICP0基因被缺失；并且，所述2个拷贝的ICP34.5基因被缺失；或者(6)所述2个拷贝的ICP0基因被缺失；并且，所述2个拷贝的ICP34.5基因各自独立地被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)；或者(7)所述2个拷贝的ICP0基因各自独立地被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)，并且，所述2个拷贝的ICP34.5基因各自独立地包含功能丧失性突变(例如一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)；或者(8)所述2个拷贝的ICP0基因各自独立地被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)，并且，所述2个拷贝的ICP34.5基因被缺失；或者(9)所述2个拷贝的ICP0基因各自独立地被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)，并且，所述2个拷贝的ICP34.5基因各自独立地被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)；优选地，在所述重组HSV病毒的基因组中，(1)第一拷贝的ICP0基因包含第一功能丧失性突变，第二拷贝的ICP0基因包含第二功能丧失性突变；并且，第一拷贝的ICP34.5基因包含第三功能丧失性突变，第二拷贝的ICP34.5基因包含第四功能丧失性突变；或者(2)第一拷贝的ICP0基因包含第一功能丧失性突变，第二拷贝的ICP0基因包含第二功能丧失性突变；并且，所述2个拷贝的ICP34.5基因被缺失；或者(3)第一拷贝的ICP0基因包含第一功能丧失性突变，第二拷贝的ICP0基因包含第二功能丧失性突变；并且，第一拷贝的ICP34.5基因被置换为第三外源核苷酸序列，第二拷贝的ICP34.5基因被置换为第四外源核苷酸序列；或者(4)所述2个拷贝的ICP0基因被缺失；并且，第一拷贝的ICP34.5基因包含第三功能丧失性突变，第二拷贝的ICP34.5基因包含第四功能丧失性突变；或者(5)所述2个拷贝的ICP0基因被缺失；并且，所述2个拷贝的ICP34.5基因被缺失；例如，所述重组HSV病毒的基因组缺失了野生型HSV-1病毒基因组的nt510至nt5439之间的碱基序列以及nt120802至nt125731之间的碱基序列；或者(6)所述2个拷贝的ICP0基因被缺失；并且，第一拷贝的ICP34.5基因被置换为第三外源核苷酸序列，第二拷贝的ICP34.5基因被置换为第四外源核苷酸序列；或者(7)第一拷贝的ICP0基因被置换为第一外源核苷酸序列，第二拷贝的ICP0基因被置换为第二外源核苷酸序列；并且，第一拷贝的ICP34.5基因包含第三功能丧失性突变，第二拷贝的ICP34.5基因包含第四功能丧失性突变；或者(8)第一拷贝的ICP0基因被置换为第一外源核苷酸序列，而第二拷贝的ICP0基因被置换为第二外源核苷酸序列；并且，所述2个拷贝的ICP34.5基因被缺失；或者(9)第一拷贝的ICP0基因被置换为第一外源核苷酸序列，第二拷贝的ICP0基因被置换为第二外源核苷酸序列；并且，第一拷贝的ICP34.5基因被置换为第三外源核苷酸序列，第二拷贝的ICP34.5基因被置换为第四外源核苷酸序列。3.权利要求2的重组HSV病毒，其中，所述第一功能丧失性突变、第二功能丧失性突变、第三功能丧失性突变和第四功能丧失性突变各自独立地选自错义突变、无义突变、移码突变、碱基缺失、碱基置换、碱基添加、以及其任何组合(例如，基因片段的缺失或置换或添加)；和/或，所述第一外源核苷酸序列、第二外源核苷酸序列、第三外源核苷酸序列和第四外源核苷酸序列各自独立地编码选自下列的外源蛋白：荧光蛋白、免疫调节多肽、细胞因子、趋化因子、抗体和细胞毒性肽；优选地，所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白(例如，具有如SEQIDNO:7所示氨基酸序列的绿色荧光蛋白)，红色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白，黄色荧光蛋白，及其任何组合；优选地，所述免疫调节多肽选自CD40L、OX40L、可诱导共刺激分子(ICOS)、FTL3L、LIGHT、CD137L、CD70、4-1BB、GITR、CD28，及其任何组合；优选地，所述细胞因子选自白介素(例如IL-2、IL-12和IL-15)、干扰素(例如IFNα、IFNβ、IFNγ)、肿瘤坏死因子(例如TNFα)、集落刺激因子(例如GM-CSF)，及其任何组合；优选地，所述趋化因子选自CCL2、RANTES、CCL7、CCL9、CCL10、CCL12、CCL15、CCL19、CCL21、CCL20、XCL-1，及其任何组合；优选地，所述细胞毒性肽选自胸苷激酶TK(TK/GCV)、TRAIL、FasL，及其任何组合；优选地，所述抗体选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIGIT抗体、抗BTLA抗体、抗CTLA-4抗体、抗Tim-3抗体、抗Lag-3抗体、抗CD137抗体、抗OX40抗体、抗GITR抗体、抗CD73抗体、抗KIR抗体、抗ICOS抗体、抗CSF1R抗体、抗EGFR抗体、抗VEGFR抗体、抗HER2抗体、抗PDGFR抗体，及其任何组合。4.权利要求1-3任一项的重组HSV病毒，其中，所述重组HSV病毒的基因组包含能够表达功能性UL43蛋白的UL43基因，能够表达功能性UL41蛋白的UL41基因(即，vhs基因)，和/或，能够表达功能性UL48蛋白的UL48基因(即，VMW65基因)；优选地，所述重组HSV病毒还具有选自下列的一个或多个特征：(1)一个或多个非必需基因被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)；优选地，所述非必需基因选自UL3基因，UL4基因，UL14基因，UL16基因，UL21基因，UL24基因，UL31基因，UL32基因，US3基因，UL51基因，UL55基因，UL56基因，US2基因，US12基因(即，ICP47基因)，LAT基因，对应于JQ673480.1的nt5853-nt7485的核苷酸片段，及其任何组合；优选地，UL55基因、US2基因、LAT基因和对应于JQ673480.1的nt5853-nt7485的核苷酸片段中的一个或多个被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)；(2)所述重组HSV病毒的必需基因未被缺失，且不包含功能丧失性突变；优选地，一个或多个必需基因(例如，ICP27基因、ICP4基因、VP5基因、gL基因、gH基因、gD基因、gK基因、gB基因、gN基因、UL5基因、UL6基因、UL8基因、UL9基因、UL12基因、UL25基因、UL26基因、UL28基因、UL29基因、UL30基因、UL33基因、UL36基因、UL38基因、UL42基因、UL48基因和/或UL52基因)的原生启动子被替换为肿瘤特异性启动子，例如hTERT的启动子；和(3)除了2个拷贝的ICP0基因和2个拷贝的ICP34.5基因之外，所述重组HSV病毒的基因组含有野生型HSV病毒的所有其他基因，并且所述其他基因均不包含功能丧失性突变；优选地，所述重组HSV病毒的基因组还包含下述修饰：一个或多个HSV基因的原生启动子被替换为肿瘤特异性启动子，例如hTERT的启动子；优选地，所述HSV基因选自VP5基因、ICP27基因和ICP4基因；优选地，所述重组HSV病毒的基因组还包含有选自下述的一项或多项修饰：(1)VP5基因的原生启动子被替换为肿瘤特异性启动子，例如hTERT的启动子；(2)ICP27基因的原生启动子被替换为肿瘤特异性启动子，如hTERT的启动子；(3)ICP4基因的原生启动子被替换为肿瘤特异性启动子，如hTERT启动子；和(4)UL55基因、US2基因、LAT基因和对应于JQ673480.1的nt5853-nt7485的核苷酸片段中的一个或多个被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)；优选地，所述hTERT启动子具有如SEQIDNO:5所示的序列。5.权利要求1-4任一项的重组HSV病毒，其中，所述重组HSV病毒还包含第五外源核苷酸序列；优选地，所述第五外源核苷酸序列编码选自下列的外源蛋白：荧光蛋白、免疫调节多肽、细胞因子、趋化因子、抗体和细胞毒性肽。6.一种病毒载体，其包含根据权利要求1-5任一项的重组HSV病毒的基因组或者由根据权利要求1-5任一项的重组HSV病毒的基因组组成。7.一种病毒载体，其包含或者由经突变的HSV基因组组成；所述经突变的HSV基因组不表达功能性ICP0蛋白和功能性ICP34.5蛋白，但能够表达功能性UL43蛋白，功能性UL41蛋白(即，vhs蛋白)，功能性UL48蛋白(即，VMW65蛋白)，或其任何组合；优选地，所述经突变的HSV基因组衍生自HSV-1病毒，HSV-2病毒，或HSV-1/HSV-2嵌合病毒的基因组；优选地，所述经突变的HSV基因组衍生自HSV-1病毒株KOS的基因组；优选地，所述经突变的HSV基因组衍生自GenBank:JQ673480.1所示的基因组。8.权利要求7的病毒载体，其中，所述经突变的HSV基因组包含下述修饰：2个拷贝的ICP0基因各自独立地包含功能丧失性突变(例如，一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)或者被缺失或者被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)；并且，2个拷贝的ICP34.5基因各自独立地...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄承浩，罗勇，袁权，张军，夏宁邵，
申请(专利权)人：厦门大学，北京万泰生物药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35